基于线粒体Cyt b DNA阿拉善马鹿分子系统学研究

乔付杰 李俊乐 高 惠 滕丽微，2 王继飞 刘振生，2*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040；2.国家林业和草原局野生动物保护学重点开放实验室，哈尔滨，150040；3.宁夏贺兰山国家级自然保护区管理局，银川，750021)

阿拉善马鹿(Cervuselaphusalxaicus)是马鹿(C.elaphus)的一个亚种，为国家Ⅱ级重点保护野生动物[1]。马鹿属偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Ceridae)鹿亚科(Cervinae)，我国分布有8个马鹿亚种，分别为天山亚种(C.e.songaricus)、塔里木亚种(C.e.yarkandensis)、阿尔泰亚种(C.e.sibiricus)、甘肃亚种(C.e.kansuensis)、阿拉善亚种(C.e.alxaicus)、四川亚种(C.e.macneilli)、西藏亚种(C.e.wallichi)和东北亚种(C.e.xanthopygus)[2]。阿拉善马鹿目前仅分布于宁夏和内蒙古交界的贺兰山中段，是我国唯一幸存的该亚种的有效种群[2-4]，刘振生等[5-6]和骆颖等[7]已对贺兰山地区阿拉善马鹿的生境选择进行了较为详细的研究，高惠等就该地区阿拉善马鹿的生境适宜性做了评价[8]。但目前关于野生阿拉善马鹿的分子研究尚属空白。

线粒体DNA是母系遗传，具有分子量小，进化速度快等特点。其Cytb区基因的进化速度适中，一个较小的基因片段就包含着从种内到种间的遗传进化信息[9]，对种群遗传多样性有很重要的作用。本文对采自贺兰山的野生阿拉善马鹿粪便样本进行DNA提取、线粒体Cytb区DNA序列测定和分析，分析该物种的遗传变异和其他中国分布的马鹿亚种的遗传分化，为其遗传多样性保护提供科学依据，对该物种的合理管护、促进种群发展具有重要意义。

1 研究地概况

贺兰山位于宁夏回族自治区和内蒙古自治区交界处(38°21′—39°22′ N，105°49′—106°42′ E)，由内蒙古贺兰山国家级自然保护区和宁夏贺兰山国家级自然保护区组成。海拔一般为2 000—3 000 m，为典型的大陆性气候，植被依据海拔的上升呈明显的垂直分异，自下而上依次为山地草原带(1 400—1 600 m)，山地疏林草原带(1 600—2 000 m)，山地针叶林带(1 900—3 000 m)，亚高山灌丛和草甸带(3 000—3 556 m)[10]。

2 材料与方法

2.1 样品采集与DNA提取

在2016年8—9月和2017年2—3月在贺兰山地区采集马鹿野生群体的新鲜粪便样本396份(图1)。采集时使用一次性PE手套，防止交叉污染，并用手持GPS定位。采集的粪便倒入无水乙醇保存，运回实验室后冷冻保存。使用QIAGEN QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 试剂盒提取DNA，具体实验方法见试剂盒详细使用说明书，将提取好的DNA分成两份，一份放置于-20℃用于下一步的扩增使用，一份放置于-80℃冻存。

图1 研究区域与采样点Fig.1 Study area and sampling points

2.2 物种鉴定

PCR扩增线粒体Cytb区全序列。引物为上游：5′-GAAAAACCATCGTTGTCATTCA-3′；下游5′-GGAGGTTGGTAGCTCTCCTTTT-3′[11]，扩增片段大小约1 200 bp。PCR反应体系：反应体系为25 μL，按顺序分别将2×PCR buffer for KOD FX Neo 12.5 μL，2 Mm dNTPs 5 μL，10 pmol/μL上游引物 0.75 μL，10 pmol/μL下游引物0.75 μL，PCR grade water 3.5 μL，模板DNA 1.5 μL，KOD FX NEO(1.0 OU/L)1 μL。PCR反应程序为：94℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40个循环；反应结束后在68℃再延伸7 min，4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工生物公司纯化并双向测序，测序引物为扩增引物。

2.3 个体识别

经物种识别确定后的马鹿粪便样品使用多态性较高的9对微卫星引物CSSM19、BM1818、T501、BM3628、T530、RT1、DM45、HAUT14、T156[12-16]进行基因分型分析，共筛选得到粪便DNA质量较高的297份样本，识别出278个阿拉善马鹿个体，并用于后续的种群遗传多样性研究。

2.4 数据分析

利用Bioedit 7.0.5.3[17]对测得的序列进行排列对比并辅以人工校对，用DNASP 5.00.07[18]计算核苷酸多样性(Nucleotide diversity，π)和单倍型多样性(Haplotype diversity，h)，以对马鹿种群的遗传多样性进行评估，用MEGA 7.0.26[19-21]和MrBayes v3.2.6[22]以梅花鹿(C.nippon)序列(登录号：AB211429)作为外群构建系统发育树，用Network 5.00.3[23]以 Median-joining 法构建各单倍型之间网络关系图，并对图中各个单倍型进行群体对应关系分析。

3 结果

本实验成功扩增出107个阿拉善马鹿Cytb区基因全序列，序列长1 075 bp，碱基T的平均含量为29.38%，碱基C的平均含量为26.69%，碱基A的平均含量为30.31%，碱基G的平均含量为13.62%，A+T的平均含量为59.68%，显著高于C+G的平均含量40.32%。因此阿拉善马鹿线粒体Cytb区富含碱基A和T并反G偏歧。说明碱基含量具有一定的偏歧性，符合哺乳动物碱基组成比例。

在获得的1 075 bp全序列中，保守位点有1 065个，变异位点有10个，均为碱基置换无插入缺失，其中单突变位点7个，简约变异位点3个，占分析位点的0.93%。单突变位点5、15、47、174、253、389、1 038，保守位点11、1 039、1 040。共定义了10个单倍型，其中有93个个体共享1个单倍型，6个个体共享1个单倍型，其他单倍型均为独有的。单倍型多样性(h=0.243)，核苷酸多样性(π=0.000 32)。中性检验得到Tajima’sD值为-2.073 91(P<0.005)，Fu and Li’sD值为-3.610 35(P<0.02)。

基于本研究的序列数据(Hap_1—Hap_10)与从 GenBank 中检索获得的 15条近缘马鹿群体(Hap_11—Hap_24)的线粒体CytbDNA全序列，采用邻接(NJ)法构建系统发生树(Kimura 2-parameter model)通过1 000次的自举检验估计系统发育关系树构建中节点(图2)，用Modeltest 3.7分析得到最佳模型HKY+I(-lnL=2 007.419 2，AIC=4 024.838 4)，马尔科夫链的蒙特卡洛法(MCMC)运行100万代，取样频率为100代，丢弃25%老化值(burnin samples)(图3)。登录号：东北马鹿：AB021097(共享Hap_1)、AF423197(Hap_11)、GU457434(Hap_12)、JF893493(Hap_13)、KM410148(Hap_14)、JF893494(Hap_15)；天山马鹿：HQ191429(Hap_16)、KJ025072(Hap_17)、KF781108(Hap_18)、KF781115(Hap_19)、KF781114(Hap_20)；西藏马鹿：AY044861(Hap_21)；四川马鹿：AY035875(Hap_22)；甘肃马鹿：AY070223(Hap_23)、AB021098(Hap_24)。结果发现这24个单倍型分为明显的2支，阿拉善马鹿线粒体CytbDNA单倍型聚为一个单系，与东北马鹿亲缘关系较近。依据 Network 软件以中接法(Median-joining)构建的单倍型进化网络关系图显示(图 4)，Hap_1—Hap_10大部分单倍型之间经过一步突变，Hap_1做为阿拉善马鹿祖先单倍型。单倍型进化网络图进一步支持了系统发育树的分析，阿拉善马鹿10个单倍型与其他引用的单倍型明显分离形成两个类群。

图2 使用邻接法构建的24个单倍型的系统发生树Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed from the 24 Cyt b haplotypes

图3 基于线粒体Cyt b区单倍型构建的贝叶斯系统发育树Fig.3 MrBayes phylogenetic tree constructed from the 24 Cyt b haplotypes

图4 24个单倍型的网络关系Fig.4 Network relationship of the 24 haplotypes

4 讨论

本次研究采集的样品为非损伤取样方法采集，使用粪便样本提取的DNA数量有限且质量较差，线粒体标记可能出现扩增错误等问题。在采样过程中尽可能采集新鲜粪便以保证提取的DNA质量，在实验过程中通过双向测序和重复测序的方法，让每个DNA样品至少通过两次独立的扩增、测序来保证其测序结果的准确性。

遗传多样性是评估种群在野外长期生存能力的重要指标，也是制定物种保护计划所必需的内容之一。衡量一个种群线粒体DNA多样性有两个指标：单倍型多样度值(h)和核苷酸多样度值(π)。h值和π值越大，群体的多态性程度越高，遗传多样性也越丰富。通过与其他马鹿亚种线粒体Cytb区DNA的研究相比较，发现阿拉善马鹿的h值和π值都较低(表1)。表明阿拉善马鹿的遗传多样性较低，分析原因可能是贺兰山周围被城市、沙漠、河流(黄河)隔断形成孤岛的地理特征所影响，易发生近亲繁殖，缺少有效的基因交流，从而导致阿拉善马鹿种群的遗传多样性降低。

在本研究的10个突变位点中无碱基插入和缺失，说明该物种的线粒体CytbDNA突变是近期发生的[26]。且在系统发生树中明显看到阿拉善马鹿聚为一个单系，这与同域分布的贺兰山岩羊在中国不同地理种群的系统发生树结果相似[27]。中性检验除Fu’sFs为显著负值外，都为不显著的负值，表示群体可能经历过种群扩张。从系统发生树与单倍型的网络关系图中发现阿拉善马鹿与东北马鹿亲缘关系较近，与甘肃马鹿、四川马鹿、西藏马鹿亲缘关系较远。

表1 多个马鹿亚种的遗传多样性参数比较

Tab.1 Comparison of genetic diversity parameter of muti-subspecies of red deer

本研究证明了阿拉善马鹿遗传多样性较低，且与东北马鹿亲缘关系较近，与中国分布的其他马鹿亚种亲缘关系较远。在本研究的系统发育树中(图2，图3)看到中国分布的这6个马鹿亚种先分化成两支，后分化出东北马鹿、甘肃马鹿、四川马鹿、西藏马鹿和阿拉善马鹿(图2)。进一步证明了中国马鹿是从中东和欧洲返回大陆的过程中是从西向东逐渐分化的[4]，这为中国马鹿的分子系统进化和大陆迁移史研究提供了科学依据。

致谢：感谢宁夏贺兰山国家级自然保护区和内蒙古贺兰山国家级自然保护区的工作人员在样品采集过程中给予的帮助。