基于ISSR分子标记的石楠属植物遗传多样性分析

蒋笑丽，章建红*，李玉祥，王正加

(1.宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040； 2.宁波市佳禾生态科技有限公司，浙江 宁波 315801； 3.浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室, 浙江 杭州 311300)

蔷薇科Rosaceae石楠属Photinia在蔷薇科中是个大家族，全世界有60多种，我国约有40种，其中大多数花、叶、果俱美，有较高的观赏价值[1]。由于其树形端正，可自然成形，适于公园、花园及路旁交叉点缀，三角地栽植，有时也被用作绿篱、绿屏，因其对二氧化碳、氯气有较强抗性，且有隔音功能，又可用于街道、厂矿绿化。目前，我国拥有世界上最大的石楠属植物栽培面积，由于国内绿化苗木产业长期存在“重引轻育”的现象，其育种和品种改良工作发展十分缓慢，现有栽培品种均为国外育种专家选育，国内对石楠属植物的选育和遗传改良的工作几乎为零[2-9]。

目前，ISSR分子标记技术已广泛应用于水稻(Oryzasativa)、马铃薯(Solanumtuberosum)、小麦(Triticumaestivum)等作物的品种鉴定、遗传亲缘关系分析和遗传图谱构建[10]。然而，该技术应用于石楠属植物遗传育种研究却鲜有报道。ISSR与RAPD相比，其可靠性更高，重复性好，每个引物能产生更高的多态性；同时，ISSR的操作也简单。与RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、稳定、成本较低、DNA用量小，安全性较高[11]。本研究将利用ISSR分子标记技术对18个石楠属植物样品进行遗传多样性分析，探讨其遗传亲缘关系，从而为创新种质资源及选育新品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究中所需试材于2017年5月15日采自浙江宁波与临安两地，相关信息见表1。每个样品采集5个单株的植株嫩叶2片，使每个混合样品达5 g以上，用生物冰袋保存，带回实验室后置于-80 ℃低温保存备用。

表1 供试材料的相关信息

注：采集地浙江临安的为采自浙江农林大学校园的植物园内，采集地浙江宁波的为采自宁波市农业科学研究院位于鄞州区东钱湖镇高钱村的实验园区内。红叶石楠金凤凰、石楠幻彩为宁波佳禾生态科技有限公司自主选育的植物新品种权授权品种，红叶石楠黄斑、红叶石楠银边、红叶石楠彩边均为宁波佳禾生态科技有限公司自主选育的优良株系，尚未申报新品种权，为暂定名。

1.2 DNA提取

参考相关文献中的CTAB法[12]提取的嫩叶中基因组DNA，纯化后分别通过1.5%琼脂糖凝胶电泳、分光光度计对其浓度及D值的检测，电泳条带单一、清晰明亮，且点样孔内没有残余，则提取的DNA质量较好。

1.3 ISSR引物的筛选及ISSR反应体系的建立

首先选取浙江本地分布的落叶种垂丝石楠与国外引进的常绿种红叶石楠红罗宾2个形态与地理关系差异明显的DNA，对50个引物进行PCR扩增，筛选出能够在2份DNA中同时扩增出条带的引物，然后使用所有试材DNA对上述筛选出的引物再次进行PCR扩增，最后可得到多态性引物。

PCR体系的总体积为20 μL，其中含DNA模板1 μL(100 ng)，引物0.5 μmol·L-1，Taq0.067 U·μL-1，dNTP 0.2 mmol·L-1, Mg2+2.5 mmol·L-1，10×缓冲液2 μL(所有试剂均购自上海生物工程公司)，ddH2O 12.4 μL。 PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，退火温度退火30 s，72 ℃延伸90 s，35次循环；最后72 ℃延伸7 min；于4 ℃保温，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶(含EB)，于120 V恒定电压下电泳30 min之后，在紫外成像系统中观察照相并保存。

1.4 数据分析

通过对各个引物的ISSR扩增图谱进行条带统计，观察每个引物对18个材料的扩增条带，记录该引物在18个材料中不同迁移位置的条带总数即为扩增总条带数；扩增条带最少的材料，其条带数即为共有条带数。多态性比率=(总条带数-共有条带数)/总条带数×100%。在凝胶的同一个位置，出现条带的记为“l”，无条带的记为“0”，建立原始数据表。利用NTSYS计算遗传相似系数，用非加权成组配对算数平均法(UPGMA)，根据遗传相似系数进行聚类分析[13]。

2 结果与分析

2.1 DNA的检测

图1为18个石楠属植物样品提取的DNA电泳图，在电泳图中条带清晰，亮度高，无明显拖尾和弥散现象，DNA完整性较好，无降现象，提取的纯度较好。如果点样孔中近有少许亮带存在，说明提取的基因组DNA中仍有大分子物质存在没有被去除。

2.2 多态性

对50个ISSR引物进行初筛，最终筛选出9条引物用于所有样品扩增，共获得54条谱带，其中50条具有多态性，多态性比率为92.59%。其中图2为57号引物对18个石楠属植物样品DNA扩增的谱带情况。9条引物平均每对引物扩增出谱带6条，平均5.6条具有多态性(表2)。

图1 18个石楠属植物样品的DNA电泳结果

图2 57号引物ISSR扩增的谱带

表2 ISSR引物的扩增结果

2.3 聚类

基于9个引物的扩增结果数据，通过聚类分析得到各样品间相似系数为0.28～0.90，从表3可知，小叶石楠与伞花石楠相似度达0.9，亲缘关系最近；其次是红叶石楠银边与小叶红叶石楠相似度0.88；亲缘关系最远的是红叶石楠银边和短叶石楠，相似度仅0.28。从图3中可以看出，在相似系数0.60左右的位置可以将18个石楠属植物样品分为5大类：Ⅰ类为椤木石楠、垂丝石楠、小叶石楠、伞花石楠、绒毛石楠、玉兰叶石楠；Ⅱ类为中华石楠、光叶石楠、罗城石楠；Ⅲ类为石楠、红叶石楠红罗宾、红叶石楠黄斑、红叶石楠银边、红叶石楠彩边、小叶红叶石楠；Ⅳ类为短叶石楠；Ⅴ类为石楠幻彩、红叶石楠金凤凰。从聚类分析树状图中可以看出，这5类遗传距离较远，说明它们的亲缘性也较远。

表3 18个石楠属植物样品的相似系数

图3 基于ISSR分子标记的18个石楠属植物试材的聚类树

3 小结与讨论

遗传多样性是生物种质资源多样性的主要评价内容，可为其遗传育种提供依据。本研究使用9个ISSR引物对18个石楠属植物进行了遗传多样性分析，从聚类分析图看出，在遗传相似系数为0.6时，18个石楠属植物被分为5类；并且9个引物扩增共获得54条带，其中有50条具有多态性，说明石楠属植物的遗传多样性较高。另外，聚类分析结果表明，不同石楠属植物间的遗传差异较大，ISSR相似系数为0.28～0.90，小叶石楠与伞花石楠遗传距离最近，两个标记的相似度均最高，因为小叶石楠与伞花石楠形态上最为接近，两者均为伞形花序，花量极少，而其他石楠属植物为伞房或复伞房花序，且花量多，因而与其有明显区别。从遗传距离的远近与地理种源的相关性来看，国外引进的红叶石楠系列品种能较好地聚在一起，短叶石楠产于贵州，而其他石楠属植物在浙江均有分布，因而短叶石楠与其他国内种的石楠属植物遗传距离也较远，说明了石楠属植物的遗传亲缘关系与地理种源分布存在紧密联系。

红叶石楠是石楠杂交种的统称，红叶石楠是石楠杂交种，因而其系列品种与石楠聚合成一组；椤木石楠是常绿小乔木，与垂丝石楠、小叶石楠、伞花石楠、绒毛石楠、玉兰叶石楠等落叶灌木聚在一起；而中华石楠为落叶灌木，又和光叶石楠、罗城石楠等常绿灌木聚在一起，说明石楠属植物亲缘关系的远近与常绿和落叶、乔木还是灌木并没有完全

的相关性。

总之，本研究结果表明，ISSR分子标记技术在石楠属植物的基因型差异上表现出较高的多态性，能够更好地分析石楠属植物的遗传多样性和亲缘关系。另外，聚类分析的结果从分子水平上印证了这些石楠属植物之间的遗传亲缘关系，能够为后续石楠属植物杂交育种中亲本选配提供一定的参考依据。