施用解淀粉芽孢杆菌对烟株生长和根际土壤微生物区系的影响

樊祖清，芦阿虔，王海涛，王 岩，段宏群，李红丽，邱 光

(1.郑州大学 化工与能源学院，河南 郑州 450001; 2.中国烟草总公司河南省公司，河南 郑州 450000；3.河南省洛阳市烟草公司，河南 洛阳 471000; 4.江苏省苏科农化有限责任公司，江苏 南京 210014)

烟草黑胫病和根结线虫病的防控是烟叶生产中面临的重要难题[1]。据统计，每年因各种土传病害所导致的烟草总产值损失高达百亿[2]。研究表明，烟叶线虫病害与细菌、真菌及其他病毒病害等具有显著的协同或联合侵染机制[3-4]。土传病害发生的原因很多，但其根源是由于长期施用化肥、农药造成土壤板结、土壤肥力严重下降，最终导致土壤微生态失衡、微生物群落结构改变、病原菌数量增多，进而加剧了土传病害的发生[5-7]。生物防治是指采用天然存在的拮抗微生物抑制作物病原菌繁殖，降低土传病害发生的一项绿色、生态、高效新技术，已成为当前国内外农业病虫害绿色防控研究热点之一[8-9]。

解淀粉芽孢杆菌B1619是江苏省农业科学院植物保护研究所研发的一种新型生防菌，由江苏省苏科农化有限责任公司将其开发为一种颗粒状的生物菌剂，有效菌含量达到108cfu/g以上[10]。解淀粉芽孢杆菌B1619生物菌剂对多种土传病害如枯萎病、青枯病、根腐病和根结线虫病等具有较好的防控效果，可用于多种作物，从而达到修复土壤生态环境的目的[11]。蒋盼盼[12]、杨晓云等[13]研究发现，解淀粉芽孢杆菌B1619对番茄、黄瓜等蔬菜作物的根结线虫病防治效果显著，作物增产明显；张斌[14]和向亚萍等[15]在研究中指出，施用解淀粉芽孢杆菌B1619生物菌剂可以有效防控番茄枯萎病。这些研究的共同之处是，施用解淀粉芽孢杆菌B1619生物菌剂可以改变作物根际土壤微生物的种类和数量，进而降低土传病害的发生，并促进作物增产。土壤中微生物数量和群落结构与土壤健康水平息息相关，有益微生物的减少、病原微生物的增加会明显提高作物的发病程度[16]，而添加有益微生物菌剂则可明显缓解此类状况发生。解淀粉芽孢杆菌B1619生物菌剂在瓜果蔬菜生产中的应用研究已有报道，而对烤烟生长及烟田微生物的影响尚未见报道。鉴于此，向烟田中施用解淀粉芽孢杆菌B1619生物菌剂，考察了烟株生长过程中根际土壤微生物区系的变化以及烟株农艺性状的变化，进而分析根际微生物群落结构变化与土传病害发生间的联系，为有效防治烟草土传病害发生提供理论和技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验田概况与供试材料

试验选择在河南省宜阳县黑胫病和根结线虫病多发的烟区进行，具体地点为盐镇乡谢村，供试地块连续3 a植烟，土壤种类为红黏土，pH值为7.0，有机质含量为22.98 g/kg，全氮含量为1.21 g/kg，碱解氮含量为67.5 mg/kg，有效磷含量为30.8 mg/kg，速效钾含量为163.6 mg/kg。供试解淀粉芽孢杆菌B1619生物菌剂(颗粒状，有效菌含量达108cfu/g以上)由江苏省苏科农化有限责任公司生产。供试烟叶品种为豫烟6号。

1.2 试验设计

试验设置2个处理，即处理(T)和对照(C)。C按照当地常规施肥进行。T在常规施肥基础上再施用2次B1619生物菌剂，具体方法：第1次在烟草移栽时穴施，施用量为120 kg/hm2；第2次在团棵期浇施，施用量为 60 kg/hm2。

1.3 样品采集、测定项目及方法

1.3.1 样品采集 在烟草移栽前、团棵期、旺长期和成熟期分别采集烟株根际土样，按“S”法进行五点取样。土样样品预处理：一部分置于4 ℃下冷藏，用于检测室内可培养微生物；另一部分装离心管后冷冻寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序。

1.3.2 可培养微生物数量 土壤中可培养微生物的数量采用涂布平板法测定[17]。细菌数量测定采用牛肉膏蛋白胨培养基；真菌数量测定采用孟加拉红培养基；放线菌数量测定采用高氏一号培养基。

1.3.3 宏基因组微生物测序 采用宏基因组微生物分类测序测定土壤样品中细菌和真菌微生物，由于放线菌门隶属于细菌界，故宏基因组不单独测定放线菌门。测序结果采用Alpha多样性、细菌(真菌)群落结构及其差异性表示[18]。

1.3.4 烟株农艺性状和发病率 在团棵期和旺长期测定烟株有效叶数、株高、茎围和腰叶大小，成熟期计算产量、产值并测定烤烟黑胫病和根结线虫病的发生情况，收获后检测烤后烟叶化学成分。

1.4 数据处理

采用Excel 2007和SPSS 17软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 施用解淀粉芽孢杆菌对烟株根际可培养土壤微生物数量的影响

如表1所示，处理T和对照C烟株根际土壤可培养微生物的数量随着烟株生长呈先增加后减少的趋势，细菌和放线菌数量在团棵期达到最大，而真菌数量在旺长期达到最大。这可能是由于团棵期烟株根系分泌物多且适宜于细菌和放线菌的生长，旺长期根系分泌物可能更适宜于真菌生长。

在烟株生长的各个时期，处理T室内可培养细菌和放线菌数量均低于对照C，这可能是由于施用解淀粉芽孢杆菌B1619改变了土壤根际微生物的种类和结构比例，并抑制了部分细菌和放线菌的生长。团棵期，处理T与对照C的细菌、放线菌数量均差异显著；旺长期和成熟期，处理T真菌数量分别较对照C增加27.8%、48.1%，且旺长期差异显著，说明施用解淀粉芽孢杆菌对烟株根际土壤室内可培养真菌微生物的数量有明显影响。可见，施用解淀粉芽孢杆菌明显改变了烟株根际土壤微生态环境。

表1 施用解淀粉芽孢杆菌对烟株根际可培养微生物数量的影响Tab.1 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on the number of cultivatable microorganisms in rhizosphere soil of tobacco plants

注：不同小写字母表示同种微生物同一处理不同生育时期差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示同种微生物同一时期不同处理间差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicated that the same microorganism had significant difference in different growth stages under the same treatment(P<0.05)， different uppercase letters indicated significant difference of the same microorganism between different treatments at the same period(P<0.05).

2.2 施用解淀粉芽孢杆菌对烟株根际土壤微生物多样性和群落结构的影响

2.2.1 Alpha多样性分析 Alpha多样性也被称为生境内物种多样性，主要关注均匀生境下的物种数目。利用Alpha多样性分析中的OTU值、Shannon指数、Chao1指数、Coverage指数可对烟田根际土壤中微生物多样性进行判断。其中，OTU值表示将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类，然后将相似度高于97%的序列分成同一个种类的操作分类单元，故OTU值的大小可表示样本中物种数量的多少；Shannon指数用来估算样品中微生物多样性，数值越大，说明群落多样性越高；Chao1指数用于估计土壤微生物物种总数；Coverage指数表示各样品文库的覆盖率，其数值越高，样本中序列未被检出的概率越低，该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况[18]。

处理T与对照C烟田根际土壤微生物Alpha多样性测定结果如表2所示。烟草生长过程测定的Coverage指数均≥0.95，表明该数据可代表样本的真实情况。处理T与对照C烟田根际土壤细菌OTU值随烟草生育时期推进而逐渐降低，表明烟株生长过程中根际土壤细菌的多样性逐渐降低；真菌OTU值随烟草生育时期推进也基本呈逐渐降低趋势，仅处理T真菌OTU值在团棵期有所增长，这可能是由于团棵期追施解淀粉芽孢杆菌B1619后根际土壤细菌多样性改变，进而导致真菌OTU值发生变化。烟草团棵期，处理T细菌OTU值低于对照C，旺长期和成熟期表现则与团棵期相反；团棵期和旺长期处理T真菌OTU值高于对照C，成熟期则低于对照C。Chao1指数的变化与OTU值变化的趋势一样。处理T与对照C细菌Shannon指数在旺长期达到最大值，表明在旺长期根际土壤细菌微生物活跃，细菌多样性最大。处理T真菌Shannon指数在团棵期达到最大值，这期间烟田施用了生物菌剂，影响了土著微生物群落结构，可能是导致真菌多样性出现变化的原因之一；对照C真菌Shannon指数在成熟期达到了最大值，这一时期是烟叶土传病害暴发的时期，真菌群落结构多样性也有所增加。

表2 施用解淀粉芽孢杆菌对烟株根际土壤Alpha多样性的影响Tab.2 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on Alpha diversity in rhizosphere soil of tobacco plants

2.2.2 群落结构变化 宏基因组微生物分类测序结果统计表明，烟草生长各个时期根际土壤微生物的数目如表3所示。由表3可知，土壤根际细菌和真菌在属水平上种类数量随着烟株的生长而减少。其中，团棵期处理T与对照C细菌属数量相差7种，旺长期对照C细菌属数量比处理T多34种，成熟期处理T细菌属数量比对照C多29种；团棵期、旺长期处理T真菌属数量比对照C分别多22、37种，成熟期则表现为处理T比对照C少30种。在目水平和门水平上，细菌和真菌微生物种类变化较小。在烟株整个生长过程中，细菌在目、门水平上分别最多有11、4种差异变化；真菌在目、门水平上分别最多有8、1种变化。可见，施用解淀粉芽孢杆菌对根际土壤属水平微生物的种类数影响较大。

表3 施用解淀粉芽孢杆菌后烟株根际土壤微生物在属、目、门水平上的数量变化Tab.3 Microbial quantity changes in rhizosphere soil of tobacco plant at the genus,order and phylum level after application of Bacillus amyloliquefaciens

属水平细菌、真菌分布频率超过1%的微生物分别如表4、表5所示，将菌种分布频率超过5%的定义为优势菌属。由表4可知，烟株移栽前的细菌优势菌属有4种,即Exiguobacterium、Citrobacter、Gp6、Acinetobacter。团棵期处理T的细菌优势菌属与移栽前相同；对照C优势菌属较处理T少了Acinetobacter，多了Gp4。旺长期处理T优势菌属有4种，即Gp6、Gemmatimonas、Exiguobacterium、Sphingomonas。成熟期处理T优势菌属有6种，即Sphingomonas、Exiguobacterium、Gp6、Gemmatimonas、Gp4、Citrobacter。旺长期和成熟期处理T与对照C的优势菌属组成相同，但分布频率不同。Sphingomonas是降解土壤有毒物质最有效的微生物菌属之一，还具有促进烟株吸收营养和抵抗多种病原菌侵扰的作用，该菌属中某些菌株具有固氮和脱氢的特性，在维系土壤氮平衡方面有着重要作用[19]。Sphingomonas在移栽前和团棵期不属于优势菌属，但在旺长期和成熟期其分布频率上升并成为优势菌属，且处理T比对照C分别高6.98%和15.53%，说明随着烟株的生长，烟株吸收根际土壤营养、释放根际分泌物，Sphingomonas类微生物大量生长繁殖，也说明解淀粉芽孢杆菌B1619在烟株生长过程中对有益微生物的生长繁衍起到了促进作用。

表4 施用解淀粉芽孢杆菌后烟株根际土壤细菌属水平群落结构分布Tab.4 Distribution of bacterial community structure in rhizosphere soil of tobacco plant at the genus levelafter application of Bacillus amyloliquefacien %

注：3、6、11、15、18号细菌为当前国际上已发现但尚未命名的菌种，仅以代号称之；9、10、14、17、19、21号细菌为尚未确定中文名称的菌种。

Note:Numbers 3,6,11,15 and 18 were currently found in the world but not yet named,and they were designated by code only.Numbers 9,10,14,17,19 and 21 were strains whose Chinese name had not been determined.

由表5可知，烟株移栽前的真菌优势菌属有5种，即Pseudogymnoascus、Absidia、Setomelanomma、Pleospora、Cryptococcus。团棵期，处理T真菌优势菌属有6种，即Malassezia、Cryptococcus、Aspergillus、Gibberella、Thielavia、Geosmithia；对照C比处理T少了Malassezia、Aspergillus、Geosmithia，多了Pseudogymnoascus、Pleospora、Cystofilobasidium、Absidia。旺长期，处理T的真菌优势菌属有4种，即Gibberella、Aspergillus、Thielavia、Cystofilobasidium；对照C优势菌属仅有Aspergillus1种，处理T比对照C多了3种优势菌属。成熟期，处理T真菌优势菌属有5种，即Pulchromyces、Candida、Pleospora、Spizellomyces、Absidia；对照C优势菌属有3种，即Absidia、Inonotus、Ashbya；处理T与对照C仅有Absidia一种共同优势菌属。Gibberella可以分泌赤霉素，其突出的生理作用是促进植物茎的伸长，引起植株快速生长。团棵期处理TGibberella分布频率低于对照C，此时烟株的生长差异不明显；旺长期处理TGibberella分布频率比对照C高 1 058.60%，可能导致烟株生长发育加速。

表5 施用解淀粉芽孢杆菌后烟株根际土壤真菌属水平群落结构分布Tab.5 Distribution of fungal community structure in rhizosphere soil of tobacco plant at the genus levelafter application of Bacillus amyloliquefaciens %

续表5 施用解淀粉芽孢杆菌后烟株根际土壤真菌属水平群落结构分布Tab.5(Continued) Distribution of fungal community structure in rhizosphere soil of tobacco plant at the genus levelafter application of Bacillus amyloliquefaciens %

注：编号3、7、11、16、18、19、24、26为尚未确定中文名称的菌种。

Note: Numbers 3,7,11,16,18,19,24 and 26 were strains whose Chinese name had not been determined.

2.2.3 群落结构差异性分析 试验田根际土壤微生物OTU值水平上的群落聚类树状图如图1所示。从图1A可以看出，在烟株生长的各个时期，处理T与对照C烟株根际土壤细菌群落结构相似；移栽前与团棵期聚为一类，旺长期与成熟期聚为一类，二类之间差异较大，说明烟株生长后期，烟株根际土壤细菌群落结构改变较大。从图1B可以看出，成熟期处理T与对照C根际土壤真菌群落结构相似，移栽前的土壤真菌群落结构与成熟期聚为一类；团棵期处理T、对照C与旺长期处理T烟株根际土壤真菌群落结构相似，旺长期对照C烟株根际土壤真菌群落结构单独聚为一类，说明随着烟株的生长，其根际土壤真菌微生物的群落结构发生了很大变化，在旺长期变化最为明显。可见，施用解淀粉芽孢杆菌B1619生物菌剂可以改变烟株生长过程中根际土壤微生物的群落结构，且对烟株根际土壤真菌的影响更大。

A. 细菌； B.真菌A.Bacteria; B.Fungi图1 烟株根际土壤微生物OTU值水平上的群落聚类分析Fig.1 Cluster analysis of microbial community at OTU value level in rhizosphere soil of tobacco plants

2.3 施用解淀粉芽孢杆菌对烟株农艺性状的影响

由表6可知，团棵期和旺长期，处理T与对照C烟株的株高均差异显著，团棵期表现为对照C高于处理T，旺长期则相反；团棵期和旺长期，处理T烟株的有效叶数、茎围和腰叶大小均优于对照C，但差异均不显著。

表6 施用解淀粉芽孢杆菌对烟株农艺性状的影响Tab.6 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on agronomic traits of tobacco plants

注:同列不同小写字母表示同时期不同处理间差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column showed significant differences between different treatments in the same period (P<0.05).

由于试验年度烟株生长前期干旱、后期降雨较多，故烤后烟叶产量比往年低。 由表7可见， 处理T烟叶产量和产值均显著高于对照C，分别较对照C增加41.67%和77.69%。

表7 施用解淀粉芽孢杆菌对烤后烟叶产量和产值的影响Tab.7 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on yield and output value of roasted tobacco leaves

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters in the same column indicated significant differences (P<0.05).

如表8所示，处理T烤后烟叶化学成分与对照C没有显著差异，表明施用解淀粉芽孢杆菌B1619对烤后烟叶化学品质的影响较小。

2.4 施用解淀粉芽孢杆菌对烟株病害发生的影响

从表9可以看出，处理T与对照C烟株根结线虫病发病率差异不大，处理T黑胫病发病率显著高于处理C，这与预期相反。

表8 施用解淀粉芽孢杆菌对烤后烟叶化学成分含量的影响 Tab.8 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on chemical constituents of roasted tobacco leaves %

表9 施用解淀粉芽孢杆菌对烤烟发病率的影响Tab.9 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on the disease incidence of flue-cured tobacco %

3 结论与讨论

微生物作为土壤中物质转化的参与者之一，在有机质矿化、腐殖质形成和分解、植物营养转化等过程中起着不可替代的作用[20]。生物菌剂具有普通微生物效应的同时，还可以抑制病原菌的活性。近年来，利用生物菌剂防治土传病害越来越多地受到人们的重视，但是由于土壤条件的复杂性，生防效果明显和稳定的应用实例并不多见[21]。通常情况下，施用生物菌剂后有益微生物在土壤中迅速繁殖，通过分解土壤中的矿物质、增加土壤中的抗菌物质和增强碳源利用强度，在一定程度上与病原菌竞争营养物质而使病原菌无法大量繁殖，从而对土传病害起到一定的抑制作用[22]。本试验结果表明，室内可培养微生物数量随着烟株的生长先增加后减少，细菌和放线菌数量在团棵期达到最大，真菌数量在旺长期达到最大。在烟株生长的各个时期，室内可培养细菌和放线菌数量均表现为施用解淀粉芽孢杆菌处理少于对照；团棵期施用解淀粉芽孢杆菌处理真菌数量少于对照，旺长期和成熟期则与之相反。解淀粉芽孢杆菌B1619的施用，改变了烟株根际土壤微生物属水平上的生态平衡，对根际土壤微生物的群落结构和数量产生了影响，而对根际土壤目、门水平上的微生物种类影响较小。进一步分析表明，Sphingomonas在旺长期和成熟期属于优势益生菌属，且施用解淀粉芽孢杆菌处理比对照分别高6.98%和15.53%；团棵期施用解淀粉芽孢杆菌处理的Gibberella分布频率少于对照，而旺长期处理T比对照C高 1 058.60%，这与烟株生长的农艺性状表现一致。烤后烟叶化学成分和产量、产值显示，施用解淀粉芽孢杆菌B1619对烟叶化学品质并没有产生明显影响，但使烤后烟叶产量显著提高41.67%，产值显著提高77.69%。研究表明，生物菌剂对作物病害防治的效果和稳定性受多种因素影响[23]。通常情况下，由生防菌生产的生物菌剂在多年、连续施用条件下，施入的有益微生物才可能定殖并大量繁殖，之后才可能对土壤微生物结构产生显著而稳定的影响，因此，利用生物菌剂防治土传病害的大田效果需要多年的田间应用和验证。本试验施用解淀粉芽孢杆菌B1619生物菌剂对烟草黑胫病和根结线虫病的防病效果并未达到预期目标，多年连续施用的生防效果是否明显尚待进一步试验。