高压氧对糖尿病大鼠认知功能及NGF mRNA表达的影响

王风波，魏晓霏，王科，唐明薇

（成都医学院第一附属医院 康复医学科，四川 成都 610500）

2型 糖 尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）认知功能受损如未得到有效干预，可逐渐演变为人格改变和生活活动能力缺失，甚至痴呆症[1]。研究证实，T2DM可导致脑组织神经生长因子（nerve growth factor,NGF）缺失[2]。高压氧疗法广泛应用于各种脑损伤，但目前尚未查及国内外高压氧对T2DM认知功能及脑组织NGF影响作用的相关报道。本研究首次采用高压氧对T2DM大鼠进行治疗性干预，旨在探讨T2DM脑组织中NGF microRNA（NGF mRNA）表达与认知功能的关系，为高压氧治疗T2DM脑病提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

48只健康成年SD大鼠，体重240～280 g，由成都医学院动物实验中心提供，许可证号：SYXK（川）2015-196，按随机数字表法分为空白对照组（12只）、T2DM模型组（36只）。模型复制成功后，T2DM模型组大鼠再次按随机数字表法分为非干预A组（6只）、非干预B组（12只），以及高压氧A组（6只）、高压氧B组（12只）。注射链脲佐菌素10 d后，非干预A组、高压氧A组大鼠行Morris水迷宫实验检测认知功能；空白对照组、非干预B组、高压氧B组各随机取6只 大鼠脑组织检测NGF mRNA。高压氧疗程结束，非干预A组、高压氧A组再次行认知功能测验；空白对照组、非干预B组、高压氧B组检测NGF mRNA。

1.2 材料及主要设备

Trizol、DEPC及逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，链脲佐菌素（美国Sigma公司）,实验小动物高压氧舱（烟台宏远氧业有限公司G2-Y900-002型），Morris水迷宫实验系统（上海吉量科技有限公司）。

1.3 T2DM模型复制

T2DM模型组大鼠置于（25±2）℃室温适应性饲养1周，测得尾静脉血空腹血糖≤5.5 mmol/L，复制T2DM大鼠模型[3]：高糖高脂饮食饲养4周，禁食、不禁水12 h，经腹腔单次注入1%链脲佐菌素（35 mg/kg），3 d后测得尾静脉随机血糖≥16.7 mmol/L，确定模型复制成功。

1.4 高压氧治疗

注射后15 d开始，每天定时将高压氧A、B组大鼠置入高压氧舱，纯氧洗舱10 min后设置20 min内匀速加压至2.5个绝对大气压，稳压吸纯氧40 min，20 min匀速减压出舱，1次/d，共20 d[4]。空白对照组及非干预A、B组大鼠不予任何干预。

1.5 Morris水迷宫认知功能测验

Morris水迷宫认知功能测验包括：①定位航行实验。大鼠先连续训练3 d，3次/d，平台保持固定位置，训练结束次日记录大鼠120 s内从入水到爬上平台所花费的时间，为逃避潜伏期；②空间探索实验。第 5天去除平台，随机选择训练象限，将大鼠面壁置入水池，记录大鼠120 s内自由穿越虚拟平台的次数。定位航行考察大鼠学习能力，空间探索考察大鼠空间记忆 能力[5]。

1.6 脑组织NGF mRNA检测

参考文献[6]及试剂盒说明书，采用RT-PCR检测大鼠脑组织NGF mRNA。大鼠麻醉后处死取脑组织，采用Trizol法提取总RNA逆转录为cDNA。NGF正 向 引 物：5’-GCTGCACGTAGCCACCGGAC-3’，反 向 引 物：5’-GCAGCTAGTGCTGCCGTCTA-3’；β-actin为内参定量分析NGF mRNA，β-actin正向引物：5’-GCGTGATCGCTGCGAGAC-3′，反向引物：5’-CCGCGGTCGCACTCGATAC-3’。PCR反应结束，产物用琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统进行分析。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析或t检验，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般及血糖情况

T2DM模型大鼠反应变慢，皮毛光泽下降，出现多饮、多食、多尿现象，消瘦、精神状态变差等，高压氧治疗后，大鼠上述症状有所改善。

2.2 高压氧A组与非干预A组大鼠认知功能比较

高压氧治疗20 d后，高压氧A组与非干预A组逃避潜伏期比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），高压氧A组较短；高压氧A组与非干预A组穿越虚拟平台次数比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），高压氧A组次数较多。见表1。

表1 两组大鼠逃避潜伏期、穿越虚拟平台次数比较（n=6，±s）

表1 两组大鼠逃避潜伏期、穿越虚拟平台次数比较（n=6，±s）

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2.3 各组大鼠脑组织NGF mRNA水平比较

治疗前，空白对照组、非干预B组、高压氧B组脑组织NGF mRNA水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较经LSD-t检验，非干预B组、高压氧B组低于空白对照组（P＜0.05）。高压氧治疗20 d后，空白对照组、非干预B组、高压氧B组脑组织NGF mRNA水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较经LSD-t检验，高压氧B组高于非干预B组和空白对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 3组大鼠脑组织NGF mRNA水平比较 （n=6，±s）

表2 3组大鼠脑组织NGF mRNA水平比较 （n=6，±s）

注：1）与空白对照组比较，P＜0.05；2）与非干预B组比较，P＜0.05

组别 治疗前 治疗20 d空白对照组 0.93±0.47 0.97±0.14非干预B组 0.31±0.641） 0.29±0.87高压氧B组 0.34±0.591） 0.78±0.612）F值 41.639 35.258 P值 0.000 0.000

3 讨论

大量研究证实，糖尿病患者是血管性痴呆和阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）的高危人群，主要表现为学习、记忆、思维、逻辑等能力衰退，T2DM是主要的糖尿病类型，随着病情发展，患者可出现行为异常，甚至丧失社会参与能力[7]。本实验采用高糖高脂+链脲佐菌素腹腔注射复制T2DM大鼠模型，模拟人类T2DM发病进程。Morris水迷宫测验显示，T2DM模型大鼠学习记忆能力明显下降，脑组织NGF mRNA表达水平下降，提示模型复制成功。结果显示，经过20 d高压氧治疗，大鼠血糖降低，糖尿病症状改善，逃避潜伏期缩短，穿越虚拟平台次数增多，较非干预组明显改善，说明高压氧对T2DM认知功能障碍的康复起积极作用。其机制可能为[8-9]：①调节机体糖脂代谢，改善脑组织微循环及细胞代谢，有利于脑高级功能恢复；②提高脑组织氧自由基清除能力，抑制炎症反应，改善脑细胞肿胀变性；③调节神经活性物质表达水平，促进脑细胞及髓鞘的修复；④提高机体氧化应激，调节免疫功能，抑制细胞凋亡。

NGF是重要的神经营养因子之一。近年来研究证实，缺血性和出血性脑损伤的脑组织NGF阳性表达增强，NGF mRNA表达上调，有利于防止神经元死亡，改善神经系统的病理变化，促进神经系统的再生与修复[10-11]。AD模型大鼠接受NGF移植入海马区，其神经行为学得到显著提高[12]。近年来高压氧治疗糖尿病并发症获得较好疗效，有报道称连续40 d高压氧治疗后，糖尿病周围神经病变患者四肢疼痛症状缓解，肢体运动及感觉神经传导速度改善优于对照组[13]。糖尿病足患者经高压氧治疗后创面愈合情况明显改善，血清血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子水平升高[13]。本实验结果显示，T2DM模型大鼠NGF mRNA表达水平低于空白对照组，说明T2DM可显著降低脑组织NGF的合成。参照人类高压氧治疗模式，对T2DM大鼠进行2个疗程共20 d的高压氧治疗，治疗结束后大鼠脑组织NGF mRNA表达水平高于非干预组，说明高压氧疗法可促进脑组织NGF合成、代谢，提高表达水平，有利于脑细胞及神经轴突的损伤后修复，进而改善学习、记忆等认知功能。NGF对脑高级功能的积极作用可能与其特有的神经保护生物活性有关，如抑制超氧自由基、毒性氨基酸的释放及脑细胞凋亡等[14-15]。尽管糖尿病认知功能障碍越来越受到学者及医务工作者的重视，但目前治疗方式仍较局限，主要依靠药物及认知训练、作业疗法等康复治疗技术。高压氧疗法能否作为常规治疗手段长期介入，本研究或许能提供较坚实的实验基础及理论依据。