香坊肠杆菌发酵果酒的香气物质分析

刘小燕 周红丽

(1. 湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410218；2. 食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410218)

果酒是指以新鲜的水果或果汁为原料，经发酵而成的酒精度较低的发酵酒[1]，具有水果的风味和多种营养成分[2]。一般果酒的酒精含量在5%～10%，稍微高的酒精含量在14%左右[1，3]。水果的种类繁多，所以果酒风格各异。

发酵菌种的选育对果酒品质至关重要，中国果酒企业大都选择纯酿酒酵母，目前市场上果酒类发酵菌种主要以一些葡萄酒专用菌种和苹果酒专用菌种为主，其他品种的果酒发酵专用菌种尚未形成[3]。纯酿酒酵母生产的果酒虽然具有一定的果酒风味，但没有鲜明的个性特点。

本课题组从不同种类刺葡萄表皮上分离到一株高产乙醇的香坊肠杆菌，该菌能耐高酒精度，且香味独特浓郁。Chun[4]、徐赛男[5]、陈梦娟[6]和Jones[7]分别从黑龙江传统酸面团、浙东腌冬瓜、刺葡萄表皮和甘蔗渣中分离出香坊肠杆菌并对其生理生化特性进行了研究，但其发酵产生的香气成分尚未进行研究报道。本试验拟分别以苹果和梨子为原料制作发酵果酒，对其发酵过程进行跟踪检测，利用顶空固相微萃取—气相色谱—质谱联用技术分析(SPME-GC-MS)检测其香气成分，对比香坊肠杆菌发酵和安琪酵母菌发酵果酒产生的香气物质的异同，旨在探明其香气成分的种类和含量，为其能应用于果酒酿造提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜苹果和梨子：购自东之源超市；

香坊肠杆菌：实验室分离保藏；

酵母菌：安琪酵母有限公司；

偏重亚硫酸钠：分析纯，天津市化学试剂研究所；

葡萄糖：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

果胶酶：酶活≥500 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；

氯化钠：分析纯，天津市光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器：90型，上海沪西分析仪器厂有限公司；

气相色谱—质谱联用仪：GCMS-QP 2010型，岛津企业管理(中国)有限公司；

高压灭菌锅：LMQC型，山东新华医疗器械股份有限公司；

恒温培养箱：ZQPL-200型，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司。

1.3 试验方案

1.3.1 香坊肠杆菌发酵过程中香气成分跟踪检测 分别以苹果和梨子为原料接种香坊肠杆菌发酵果酒，前发酵第3,7天分别取样进行SPME-GC-MS分析，后发酵每隔7 d分别取样进行SPME-GC-MS分析，分析香气成分变化。

果酒发酵：新鲜成熟的苹果和梨子分别洗净去皮去核切块，按0.02%(质量比)加入偏重亚硫酸钠进行硫处理、压榨，按0.1%(质量比)加入果胶酶处理2 h，调整糖度至24 °Bx，按3%(体积比)接种量接种活化好的香坊肠杆菌于28 ℃恒温发酵，7 d后过滤继续发酵至28 d。

1.3.2 香坊肠杆菌与安琪酵母发酵产生的的香气物质对比

分别以苹果和梨子为原料接种3%(体积比)活化好的香坊肠杆菌发酵果酒，同时按3%(体积比)接种活化好的安琪酵母菌发酵进行对照。第28天取样进行SPME-GC-MS分析，分析对比其香气物质。

1.4 分析方法

香气物质采用SPME-GC-MS进行分析。

固相微萃取条件：移取1 mL去离子水和1 mL样品于固相微萃取瓶中，加0.2 g氯化钠，在45 ℃下平衡15 min，在45 ℃、磁力搅拌下萃取20 min，进行气质分析，解析5 min。

气相色谱条件：色谱柱：RTX-5MS；载气：He；柱流量：1 mL/min，分流比30∶1，进样口温度：250 ℃；升温程序：40 ℃保持2 min；以2 ℃/min升温至80 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升温至250 ℃，保持2 min。

质谱分析条件：离子源：电子轰击电离离子源(EI源)，检测器电压：1 500 V；离子源温度：230 ℃，GC/MS连接域温度：280 ℃；质量扫描范围：0～1 000m/z。

结果比对分析：化合物结果通过NIST 11s.lib标准质谱图库进行比对[8-11]。

2 结果分析

2.1 香坊肠杆菌发酵过程中香气成分跟踪检测

2.1.1 苹果酒发酵过程中香气物质跟踪检测 由表1、2可知，香坊肠杆菌发酵苹果酒检测出的香气物质种类主要有醇类和酯类，分别占11.68%～45.77% 和40%～56%；其次为酸类、醛类、烷烃类和苯酚。含量较高的组分为3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醇、苯乙醇及乙酸苯乙酯、3-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁基乙酸酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、异丁酸等。在发酵第14天开始检测出较高含量的庚醛，占12%，并随时间稳定上升；在发酵第28天检测出2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环，含量占10.88%。

研究发现：主要香气成分中苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香[11]，乙酸苯乙酯有甜蜜的香味[12]；苯乙醇及其酯类和低级脂肪酸构成苹果酒香气的基本骨架，脂肪酸酯特别是2-甲基丁基乙酸酯赋予苹果酒的苹果香[13]；癸酸乙酯具有椰子香、葡萄酒香[14]，李记明等[15]研究认为其能反映苹果酒中微弱的水果香、脂肪香、刺激、苦涩等香气特征；辛酸乙酯具有白兰地酒香[16]；庚醛在肉制品中呈现不良风味[17]，在茶叶中呈现青草气[18]，但嵇海峰等[19]研究认为庚醛香气活性值低，即便含量显著增加也不会对产品风味造成较大影响。这些成分共同赋予果酒酒香、果香、花香、甜香、青草气等香气特征。

随着发酵时间的延长，香气物质整体更加丰富，醇类百分含量急速下降，从发酵第3天的45.77%降到发酵第28天的11.687%；酯类种类整体增加，百分含量先升后降。

2.1.2 梨子酒发酵过程中香气物质跟踪检测 由表3、4可知：香坊肠杆菌发酵梨子酒检测出的香气物质种类主要有醇类和酯类，分别占15%～55%和35%～46.56%；其次为酸类、醛类、烷烃类、苯酚和极少量的酮。含量较高的组分为3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醇及乙酸苯乙酯、3-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁基乙酸酯、癸酸乙酯、异丁酸等。在发酵第14天开始检测出较高含量的庚醛，占11.76%，并随时间稳定上升；在发酵第28天检测出2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环，含量占8.52%。

随着发酵时间的延长，香气物质整体更加丰富，醇类的种类整体增加，但百分含量微升后急速下降，从发酵第7天的55.15%降到发酵第28天的15.87%；酯类种类整体增加，百分含量微下降，绝对含量变化有待进一步研究。

2.2 香坊肠杆菌和安琪酵母菌发酵果酒的香气物质对比分析

2.2.1 发酵苹果酒的香气物质 由图1，表5可知，分别接种香坊肠杆菌(试验组)和安琪酵母菌(对照组)发酵苹果酒检测出的香气物质中，有20种相同香气物质，有9种从试验组检测出而对照组未检测出，有18种从对照组检测出而试验组未检测出。试验组总醇11.69%，总酯40.39%；对照组总醇24.78%，总酯51.93%。

从香坊肠杆菌发酵的苹果酒中检测出的主要香气物质有庚醛、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙缩醛、辛酸乙酯、异丁酸、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、2-甲基-2-乙基丙酸乙酯、3-甲基丁基乙酸酯等，这些香气物质赋予苹果酒酒香、花香、果香、甜香、青草气等香气特征。

表1 苹果酒香气物质随时间的变化

表2 苹果酒香气物质分类汇总表

表3 梨子酒香气物质随时间的变化

表4 梨子酒香气物质分类汇总表

从安琪酵母菌发酵的苹果酒中检测出的主要香气物质有癸酸乙酯、苯乙醇、辛酸乙酯、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环、3-甲基-1-丁醇、乙缩醛、十二酸乙酯等，这些香气物质赋予苹果酒酒香、花香、果香等香气特征。

2.2.2 发酵梨子酒的香气物质 由图2，表6可知，分别接种香坊肠杆菌(试验组)和安琪酵母菌(对照组)发酵梨子酒检测出的香气物质中，有24种相同香气物质，有12种从试验组检测出而对照组未检测出，有11种从对照组检测出而试验组未检测出。试验组总醇15.87%，总酯36.35%；对照组总醇23.29%，总酯51.26%。

从香坊肠杆菌发酵的梨子酒中检测出的主要香气物质有庚醛、乙酸苯乙酯、3-甲基-1-丁醇、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环、异丁酸、乙缩醛、癸酸乙酯、苯乙醇、2-甲基-2-乙基丙酸乙酯、3-甲基丁基乙酸酯等，这些香气物质赋予梨子酒酒香、花香、果香、甜香、青草气等香气特征。

图1 苹果酒发酵第28天香气物质图谱

Figure 1 TIC diagram of aroma substance on the 28 day of apple wine fermentation

从安琪酵母菌发酵的梨子酒中检测出的主要香气物质有癸酸乙酯、苯乙醇、辛酸乙酯、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环、乙缩醛、十二酸乙酯、3-甲基-1-丁醇和己酸乙酯等，这些香气物质赋予梨子酒酒香、花香、果香等香气特征。

3 结论

香坊肠杆菌和安琪酵母发酵果酒有其相同的香气物质，但在总体上香气成分种类和含量都有很大的差异。二者既有相似的基本香气构成，又有其独特的香气特点。癸酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇等赋予二者酒香、果香和花香，其中安琪酵母菌发酵产生的癸酸乙酯、辛酸乙酯百分含量更高，果酒酒香更明显；而香坊肠杆菌发酵产生的乙酸苯乙酯和庚醛赋予果酒甜香和青草气。

图2 梨子酒发酵第28天的香气物质图谱

Figure 2 TIC diagram of aroma substance on the 28 day of pear wine fermentation

表5香坊肠杆菌和安琪酵母菌发酵苹果酒第28天的香气物质对比

Table 5 Comparison of aroma components between enterobacter aeruginosa and angel yeast fermented apple wine on the 28 Day %

组分香坊肠杆菌安琪酵母2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环10.882 69.078 7乙缩醛7.275 76.314 43-甲基-1-丁醇5.323 18.634 2醋酸异丁酯1.727 80.239 3正己醇0.583 20.996 43-甲基丁基乙酸酯3.195 91.678 82-甲基丁基乙酸酯0.875 80.338 61-(1-乙氧基乙氧基)-戊烷0.259 53.121 5己酸乙酯0.462 42.144 0壬醛0.877 50.273 2苯乙醇5.302 813.945 0十六酸乙酯1.707 50.626 6辛酸乙酯6.235 312.390 8癸醛1.553 90.676 2乙酸苯乙酯7.510 10.738 49-癸烯酸乙酯0.532 41.676 4癸酸乙酯10.381 324.897 72,4-二(1,1-二甲基乙基)苯酚1.287 20.238 6十二酸乙酯1.443 65.100 9邻苯二甲酸二乙酯1.064 10.166 22,3-二甲基己烷0.652 8甲基戊醇0.131 2二氢-2-甲基-3(2H)-噻吩酮0.477 32-乙基己醇0.222 3DL-2-羟基己酸乙酯0.166 3庚酸乙酯0.556 0樟脑0.626 4薄荷醇0.246 73,4,5-三甲基-4-庚醇0.604 1琥珀酸二乙酯0.352 0萘1.528 7苯乙酸乙酯0.233 5壬酸乙酯0.214 8辛酸3-甲基丁酯0.135 6香叶基丙酮0.176 8正十五烷0.129 3十五烷酸-3-甲基丁酯0.134 1十四酸乙酯0.135 9乙酸正丙酯0.586 3庚醛15.454 12-甲基-2-乙基丙酸乙酯4.666 7异丁酸5.923 32-甲基丁酸1.416 1奥苷菊环1.893 01-丁醇0.480 0十七烷0.456 48-甲基十七烷0.642 5

表6香坊肠杆菌和安琪酵母菌发酵梨子酒第28天的香气物质对比

Table 6 Comparison of aroma components between enterobacter aeruginosa and angel yeast fermented pear wine on the 28 Day %

组分安琪酵母香坊肠杆菌2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环8.242 68.524 8乙缩醛5.095 35.893 93-甲基-1-丁醇4.140 98.790 9庚醛5.548 614.377 72-甲基-2-乙基丙酸乙酯0.753 03.641 7异丁酸1.172 26.681 1醋酸异丁酯0.284 92.478 73-甲基丁酸0.187 60.647 52-甲基丁酸0.185 22.119 43-甲基丁基乙酸酯1.196 73.631 92-甲基丁基乙酸酯0.298 21.246 1二氢-2-甲基-3(2H)-噻吩酮0.680 60.788 82-乙基己醇0.215 30.592 6壬醛0.531 21.415 4苯乙醇17.318 44.643 5奥苷菊环1.524 82.099 8辛酸乙酯14.064 82.008 4癸醛1.381 62.580 5乙酸苯乙酯1.139 610.312 4癸酸乙酯20.574 04.936 3十二酸乙酯4.726 90.864 5十四酸乙酯0.283 60.612 7十六酸乙酯1.903 52.956 2十八酸乙酯0.179 60.494 0正己醇0.306 01 -庚醇1.143 3己酸乙酯3.043 4芳樟醇0.170 8十三碳醛0.234 6琥珀酸二乙酯0.806 0反-4-癸烯酸乙酯1.144 0辛酸3-甲基丁酯0.292 0香叶基丙酮0.317 33,5-二叔丁基苯酚0.348 29-十六碳烯酸乙酯0.565 11-丁醇0.944 6丙酸乙酯0.256 2乙酸正丙酯1.194 62,4-二(1,1-二甲基乙基)苯酚2.085 5邻苯二甲酸二乙酯0.637 2十七烷0.257 0邻苯二甲酸二异丁酯0.359 2十五酸乙酯0.303 02-癸烯-1-醇0.411 2二十烷0.316 3油酸乙酯0.407 33-甲基-1-戊醇0.488 9

由于不同香气物质阈值不同，各成分之间可能相互影响，香气成分对果酒的影响与其含量并不呈正相关，所以不能单依据香气成分含量评价香坊肠杆菌发酵果酒与安琪酵母发酵果酒的优劣。要解决此问题可结合感官品评评价香坊肠杆菌发酵果酒。