过表达人VEGF183诱导小鼠乳腺癌血管成熟

王晓银，吕探宇，夏文姣，朱武凌，张会勇

(新乡医学院生命科学技术学院，河南新乡 453003)

恶性肿瘤的生长和转移离不开营养供应[1]。目前，研究最多的与肿瘤血管生成相关的因子是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)。VEGF被认为是一种最重要的促血管生成因子，其因mRNA的剪切形成VEGF121、145、148、165、183、189与206等7种主要亚型[2-4]。VEGF通过与其受体VEGFR1、VEGFR2和Nrp1结合，在肿瘤血管生成中发挥着重要的作用[4]。有研究表明，VEGF各亚型与Nrp1结合能力的不同导致在肿瘤中不同的招募[5-6]。单核细胞表达Nrp1(Nrp1-expressing monocytes,NEMs)以自分泌的方式在新生血管周围招募平滑肌细胞促进血管成熟[7]。CD31是内皮细胞表面标志物，表示血管密度(microvessel density,MVD)[8]。α-smooth muscle actin(αSMA)是周细胞表面标志物[9]，表示周细胞数(pericyte number,PN)，而αSMA在CD31中所占的比例(PN/MVD)表示血管成熟度[10]。已有研究表明，VEGF189和VEGF165可以促进血管成熟度[11]。笔者前期研究发现，过表达VEGF183(与VEGF189相比，在外显子6a处少6个氨基酸)，可使瘤内微血管扩张[12]，但关于其对血管成熟度的影响，并未见相关研究报道。

本文主要研究稳定过表达VEGF183的乳腺癌细胞株EMT-6在BALB/C小鼠皮内接种后，对肿瘤血管成熟度的影响，并与过表达VEGF165和VEGF189做比较。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系 小鼠乳腺癌细胞株EMT-6购于美国ATCC公司，由本实验通过脂质体稳定转染获得转染pcDNA3.1空载体的EMT-6细胞株，EMT-6-pcDNA3.1(EMT-6细胞组，作对照)，过表达VEGF189的EMT-6细胞株EMT-6-pcDNA3.1-VEGF189(EMT-6-189细胞组)，过表达VEGF183的EMT-6细胞株EMT-6-pcDNA3.1-VEGF183(EMT-6-183细胞组)和过表达VEGF165的EMT-6细胞株EMT-6-pcDNA3.1-VEGF165(EMT-6-165细胞组)细胞株(上述3种细胞株VEGF表达量接近)，保存于新乡医学院合成生物学工程实验室(具体构建方法参考文献[12])。

1.1.2主要试剂 DMEM高糖液体培养基购于美国HyClone公司，血清购于美国BI公司，0.25%的胰蛋白酶购于吉林省吉诺生物医药技术有限公司。一抗：CD31兔抗小鼠(批号50408-T16)购于北京义翘神州生物技术有限公司，工作液浓度1∶2 000稀释；α-SMA兔单抗小鼠(批号ab32575)购于英国Abcam公司，工作液浓度1∶300稀释；免疫组织化学SP试剂盒(兔链霉卵白素-生物素法检测系统，批号SP-9001)、即用型DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，其余化学试剂均为分析纯级。

1.1.3实验动物 雌性的6～8周龄的BALB/c小鼠(批次号11400700216964)购于北京维通利华实验动物有限公司。本实验中的实验动物饲养与操作经新乡医学院动物伦理学委员会批准。

1.2方法

1.2.1细胞培养 稳定表达各VEGF亚型及载体的EMT-6细胞株于10%的胎牛血清与1%的双抗的DMEM高糖培养基中，置于含5% CO2的37 ℃恒温CO2培养箱中培养。

1.2.2样本制备 12只BALB/C小鼠分为4组(EMT-6，EMT-6-189，EMT-6-183和EMT-6-165组)，每组3只。小鼠先腹部右侧腋下脱毛，皮内接种 2.5×105个对应组细胞，待肿瘤长至直径约为4～5 mm时，颈椎脱臼法处死小鼠，取出肿瘤。肿瘤组织经4%多聚甲醛固定至少24 h，常规方法脱水透明浸蜡，石蜡包埋，石蜡切片机切片，厚度5 μm。

1.2.3免疫组织化学 石蜡切片经脱蜡水化；抗原修复，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次3 min；3%的内源性过氧化氢阻断剂阻断，PBS洗3次，每次3 min；正常山羊血清封闭，吸去血清，一抗孵育，4 ℃过夜，PBS洗3次，每次3 min；滴加即用型生物素标记的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min；DAB显色；苏木素复染；自来水返蓝；脱水至透明；中性树脂封片。

1.2.4检测指标的定性与定量 DAB染色后，分别于低倍镜下和高倍镜下观察，阳性反应呈棕黄色，CD31为内皮细胞膜阳性，α-SMA为周细胞胞质阳性。MVD计数：首先在100倍视野下选择计数的部位，然后在400倍视野下计数CD31阳性的血管数，每张片子选择5个不同的视野计数，计算平均值即为MVD；PN计数：与CD31计数原则一样，先在100倍视野下选择计数部位，再在400倍视野下计数α-SMA阳性周细胞数，随机选择5个不同的视野计数，计算平均值即为PN。

2 结 果

2.1各组间MVD的比较 免疫组织化学结果显示，CD31阳性主要表达在瘤周，EMT-6-183、EMT-6-165、EMT-6-189组与EMT-6组比较，CD31的阳性血管数呈现递增的趋势；与EMT-6组比较，EMT-6-189、EMT-6-183组的血管形态不同，相较于对照组与VEGF165组，VEGF183与VEGF189诱导出现了较大比例扩张的肿瘤微血管，见图1A～D。而定量分析瘤周MVD表明：EMT-6-183组MVD为4.6±1.1，EMT-6-165组的为4.8±0.8，EMT-6-189组为6.8±1.3，EMT-6组为22.8±4.8，EMT-6-165、EMT-6-183、EMT-6-189组瘤周MVD与EMT-6组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，而EMT-6-165、EMT-6-183、EMT-6-189组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，图1E。

A:EMT-6组DAB染色(×400)；B:EMT-6-189组DAB染色(×400)；C:EMT-6-183组DAB染色(×400)；D:EMT-6-165组DAB染色(×400)；E:MVD计数统计分析；a:P<0.01,与EMT-6组比较

图1 各组间的MVD表达情况及分析

2.2各组间PN的比较 α-SMA阳性细胞定位在血管外周，且主要分布在瘤周，符合周细胞的组织学分布，α-SMA阳性细胞形成管腔样微血管，见图2A～D。而PN的定量分析结果显示，EMT-6组PN为6.6±2.9，EMT-6-189组为2.4±0.5，EMT-6-165组为2.2±0.4，EMT-6-183组为1.8±0.4，EMT-6-165、EMT-6-183、EMT-6-189组与EMT-6组比较均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而EMT-6-165、EMT-6-189、EMT-6-183组各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2E。

2.3各组间PN/MVD的比较 EMT-6-183组诱导了39.2%的血管成熟度，而EMT-6-165、EMT-6-189组分别诱导了46.0%和35.38%的成熟度。EMT-6组的血管成熟度只有31.8%。

A:EMT-6组DAB染色(×400)；B:EMT-6-189组DAB染色(×400)；C:EMT-6-183组DAB染色(×400)；D:EMT-6-165组DAB染色(×400)；E:PN计数统计分析；a:P<0.01,与EMT-6组比较

图2 各组间的PN表达情况分析

3 讨 论

从已存在的血管中生出新血管的过程被称为血管新生[13]。这一过程发生在缺血性疾病、炎症性疾病和恶性肿瘤中，被称为病理性血管生成[14]。通过对肿瘤血管生成的认识，帮助我们了解肿瘤的生物学特征，从而促进开展个性化治疗。血管计数是评估血管生成的“金标准”[15]，但在某些恶性肿瘤中，血管的数目不能准确地反应肿瘤的恶性程度及生长速度。研究证实，肿瘤内血管成熟对于肿瘤的供血发挥着重要的作用[16]。周细胞和内皮细胞是血管的重要组成成分，参与诱导血管新生，同时周细胞又通过和内皮细胞相互作用共同调节血管的形成、稳定和重塑。

VEGF是已知的研究最多的促血管生长因子，本研究在EMT-6细胞株中分别稳定转入pcDNA3.1-VEGF189、pcDNA3.1-VEGF183、pcDNA3.1-VEGF165，皮内接种于BALB/c小鼠。结果表明，周细胞和内皮细胞在各组中均有表达，而在EMT-6组内，因有内源性的VEGF120及VEGF164(对应于人VEGF121与VEGF165)表达，内皮细胞数表达量较多，形成管腔状较小的血管且主要集中在瘤周，所以其瘤周MVD相对较高。但因周细胞主要表达于血管外周，表达量较少，因此PN/MVD值较低。而过表达VEGF165，尤其是过表达VEGF183与VEGF189导致血管管腔扩大，而致使瘤周血管数目减少，即瘤周MVD相对EMT-6组少。过表达VEGF189、VEGF183和VEGF165的小鼠，PN和MVD值组内差距较小，但是PN/MVD值均高于EMT-6组，且过表达VEGF183的小鼠PN/MVD值介于过表达VEGF189和过表达VEGF165之间。已有研究表明VEGF189和VEGF165能够促进血管成熟[11]，而VEGF183与VEGF189相比，结构上少了6个氨基酸，可能一定程度上影响其空间结构，使其与VEGFR1、VEGFR2和Nrp1的结合能力不同，导致对成熟度的影响不同。

本研究结果表明VEGF183与其他VEGF亚型均可促进血管成熟。肿瘤血管的成熟度直接影响化疗及免疫药物的运输[17-18]，从而影响肿瘤治疗效果。本研究可为未来依据VEGF表达的类型及血管成熟度进行肿瘤个体化治疗提供一定的理论基础。