白介素-1β在大鼠皮肤创伤后不同时段的表达

李翼彬，李俊岑，赵鑫鑫，金 昊

(1.成都市第三人民医院，四川 成都，610000；2.成都医学院实验技术教研室，四川 成都，610081)

创伤愈合是一个复杂的病理生理过程，主要包括炎症反应期、增殖期和瘢痕修复期[1]。但创伤修复的机制目前仍未完全明了。白介素-1β( IL-1β)作为创伤修复过程中较重要的细胞因子，具有促进成纤维细胞、血管内皮细胞增殖和细胞外基质沉积等作用［2-3］。但是，在皮肤创伤后不同时段不同组织部位中，IL-1β的表达变化仍不清楚。因此，本文通过建立大鼠皮肤创伤修复模型，从形态学上观察创伤后不同时段创伤皮肤组织病理变化以及IL-1β的表达变化，为进一步探讨IL-1β在创伤修复过程中的潜在机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动 物

SD 品系大鼠15只， 由成都医学院实验动物中心提供，随机分为1d、3d、7d三个时间段组，每组5只。

1.2 模型制备

各组大鼠实验前1d脱毛，称重。用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉(用量1 ml/kg体重) ，固定于手术台上，常规消毒。在距脊柱0.5cm处，用刀将1.5cm×1.5cm范围内的皮肤切除， 不伤及脊柱旁肌肉上的脂肪及筋膜， 术后每日给予标准饲料喂养，动物饲养室温维持在25～30℃。

1.3 免疫组织化学染色

各组大鼠用3.6%水合氯醛（1 ml/kg）腹腔麻醉后，切取距损伤边缘10mm的皮肤全层组织，浸泡于4%多聚甲醛溶液24-36h，石蜡包埋，沿皮肤纵切面切片，制作5μm厚的石蜡切片每组取5张石蜡切片，具体染色步骤按IL-1β免疫组化SP试剂盒说明执行。DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，树胶封片。用PBS代IL-1β抗体做阴性对照组，其余步骤不变。

1.4 结果观察

采用OLYMPUS数码照像机采集图像，观察IL-1β阳性产物在皮肤组织中的分布，用 Image-Pro Plus 6.0 图像处理软件测量未愈合面积，以及阳性反应物的平均光密度值（MD）。

1.5 统计学处理

各组未愈合面积和平均光密度值数据以均数±标准差表示，用SPSS 20.0 软件包，组间比较采用方差分析 LSD 法。

2 结 果

2.1 创伤未愈面积结果

损伤后1d、3d、7d大鼠创伤皮肤未愈合面积均逐渐缩小，各组未愈合面积均存在统计学差异（P＜0.05）如图1，表1）。

2.2 HE染色结果

损伤后1d，镜下组织间隙散布着大量红细胞，也可见扩张充血的毛细血管，小血管内可见血栓形成。损伤周围可见少量中性粒细胞等炎性细胞浸润（图2-a）。损伤后3d，肉芽组织大量形成，向创口延伸。损伤区周围可见毛细血管生成，中性粒细胞和巨噬细胞大量浸润，大量成纤维细胞存在（图2-b）。损伤后7d，肉芽组织已基本填平创口，成纤维细胞向纤维细胞转化。肉芽组织向瘢痕组织转变。损伤区周围可见大量的梭形细胞核的纤维细胞，炎性细胞少见（图2-c）。

2.3 免疫组化染色结果

2.3.1 损伤边缘 皮肤内IL-1β免疫阳性反应物的分布概况 光镜下观察到IL-1β在动物上皮组织、巨噬细胞、成纤维细胞中有表达，阳性反应物主要定位在胞核、胞浆和基质中。

图1 创伤皮肤未愈合面积：a，b，c分别示大鼠皮肤创伤后1d，3d，7d 未愈合皮肤面积

图2 创伤皮肤组织HE染色：a 损伤后1d，镜下组织间隙散布大量红细胞，可见扩张充血的毛细血管，血管内可见血栓形成。损伤周围可见少量中性粒细胞等炎性细胞浸润 (HE×400)；b 损伤后3d，肉芽组织大量形成，向创口延伸。损伤区周围可见毛细血管生成，中性粒细胞和巨噬细胞大量浸润，大量成纤维细胞存在。(HE×400)；c 损伤后7d，肉芽组织已基本填平创口，成纤维细胞向纤维细胞转化。肉芽组织向瘢痕组织转变。损伤区周围可见大量细胞核呈梭形的纤维细胞，炎性细胞少见(HE×400)。

图3 创伤皮肤组织免疫组织化学染色：a 损伤后1d，皮肤表皮细胞、扩张的血管内皮细胞、成纤维细胞、浸润的中性粒细胞中的胞浆中内可见少许IL-1β免疫反应阳性物，呈弱染色(IHC×400)；b 损伤后3d，IL-1β在表皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、的胞浆表达增强，呈强染色(IHC×400)；c 损伤后7d，表皮细胞、成纤维细胞的胞浆内IL-1β免疫反应阳性物减弱，呈弱染色(IHC×400)

2.3.2 皮肤创伤后IL-1β的变化 损伤后1d，皮肤表皮细胞、扩张的血管内皮细胞、成纤维细胞、浸润的中性粒细胞中的胞浆中可见IL-1β免疫反应阳性物(图3-a)。损伤后3d，损伤区大量炎症细胞浸润，成纤维细胞增殖，IL-1β在表皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的胞浆表达增强，表达强度明显高于损伤后1d组(P＜0.05)(图3-b)。损伤后7d，表皮细胞、成纤维细胞的胞浆内IL-1β免疫反应阳性物减弱，较损伤后3d有明显差异(P ＜ 0.05)(图 3-c)。

免疫组织化学方法对照实验结果均为阴性。

表1 不同时间段未愈合面积和IL-1β免疫反应阳性物平均光密度值 （±s）

表1 不同时间段未愈合面积和IL-1β免疫反应阳性物平均光密度值 （±s）

备注：▲大鼠皮肤创伤后1d、7d与3d比较，P＜0.05

损伤时间 平均光密度值 未愈合面积（mm2）1d 1.19±0.047▲ 146.36±0.488▲3d 1.47±0.828 143.57±1.157 7d 1.20±0.053▲ 29.13±1.065▲

3 讨 论

3.1 大鼠皮肤创伤修复面积和组织病理变化

本实验结果示：大鼠皮肤创伤后1d、3d、7d的创伤皮肤未愈面积逐渐缩小，1d、7d组与3d组存在统计学差异（P＜0.05）。损伤后1d，镜下可见真皮层毛细血管扩张充血，血栓形成，炎性细胞浸润损伤周围，表明皮肤损伤后1d处于损伤修复的止血和炎症反应阶段。相关研究显示：在皮肤创伤后的止血和炎症反应阶段，毛细血管收缩、血小板聚集、纤维蛋白凝块形成、多种修复细胞、生长因子以及细胞外基质参与此过程[4-6]。损伤后3d，肉芽组织大量形成并向创口生长，损伤区周围可见大量成纤维细胞、巨噬细胞及新生毛细血管，此期进入细胞增殖和分化阶段。Demidova-Rice TN等[7]认为：在此阶段，血管开始形成，炎症细胞及上皮细胞、真皮细胞分泌生长因子，诱导细胞增殖，启动细胞迁移。创口内大量成纤维细胞增生，合成细胞外基质，形成富含新生血管的肉芽组织。细胞增殖分化是动态进行的，细胞和细胞外基质通过生物因子介导而相互作用。损伤后7d，肉芽组织已基本填平创口，成纤维细胞大量分泌胶原蛋白；肉芽组织逐渐纤维化并向瘢痕组织转变。在损伤区周围可见大量梭形细胞核的纤维细胞，炎性细胞少见此时期进入组织重建或瘢痕形成阶段。Honnegowda TM等[8]认为肉芽组织被重塑过程中，富含胶原蛋白Ⅰ的细胞外基质将会逐渐取代胶原蛋白Ⅲ、纤维蛋白、纤连蛋白、透明质酸等。胶纤维母细胞及肌成纤维细胞逐渐向损伤区迁移，参与肉芽组织基质重建。最后，成纤维细胞凋亡，形成相对无细胞、其抗张强度和正常皮肤组织相仿的瘢痕组织。

3.2 大鼠皮肤创伤后IL-1β的表达变化

白介素1（IL-1）是一种免疫调节因子，参与了固有免疫细胞和淋巴细胞的分化，在自发性炎症、自身免疫和感染性疾病中发挥主要作用。IL-1炎症因子家族和IL-1受体成员（IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂、IL-18，IL-33 、IL-36、IL-37、IL-38）在炎症反应中通过IL-1受体发挥各自独特的作用[9-10]。本实验通过免疫组化染色对损伤边缘皮肤中的IL-1β免疫阳性反应物进行观察，并对IL-1β阳性反应物进行了光密度检测，对其表达水平行半定量分析。结果发现IL-1β在动物上皮组织、巨噬细胞、成纤维细胞中有表达，阳性反应物主要定位在胞核、胞浆和基质中。这表明了当机体受到创伤等严重打击后，体内会相续启动一系列复杂的细胞生物学效应，包括应激信号的激活和传递、炎症反应失衡、各种有害因素的释放。

本实验中，大鼠皮肤创伤后1d至3d，IL-1表达逐渐增强，在3d达到高峰，3d后随着时间的推移，表达逐渐减弱。同时，实验数据分析表明，在损伤后1d至3d，大鼠的创伤面积愈合率为2%，3d至7d的创伤面积愈合率为79%，远远大于大鼠皮肤损伤后前3天的愈合率。笔者认为大鼠皮肤愈合速度可能会随着炎症因子IL-1β的表达逐渐减弱，而逐渐增快。这可能与IL-1β激活的几条重要的信号转导途径相关，例如：IL-1受体相关激酶途径、磷脂酰肌醇3激酶信号转导途径、JAK STAT信号通路和离子通道[11]。乐海浪等[12]认为：创伤后炎症反应在创伤的病理过程中发挥了重要的作用，可能诱发部分创伤并发症，例如：脓毒症、多器官衰竭、高代谢、深静脉血栓形成等。TNFα、IL-1、IL-6、C-反应蛋白等均是创伤后炎症反应的敏感指标，能反应创伤患者的病情，评价炎症反应的严重程度。陈先玖等[13]采用舒筋活血汤治疗慢性创伤性膝关节滑膜炎患者，结果显著降低了TNF-α、IL-1β水平，改善了关节疼痛症状，提高了治疗总有效率。朱晓燕等[14]采用香连金黄散下调感染皮肤局部的炎症因子IL-1β等表达，使实验组皮肤恢复效果优于对照组。李凤蕾等[15]认为采用高剂量乌灵菌粉可改善PTSD大鼠焦虑样行为，这种作用可能与其降低海马组织中IL-1β、IL-6的水平有关。因此，临床中可通过早期监测这些重要炎症指标，采取适当的措施阻止炎症反应的进一步发展，以有效降低MODS发生率，减少创伤患者死亡率，促进创口愈合，缩短愈合周期。

但是，损伤修复的作用机制并不是通过单一因子的调节，而是一个复杂的分子网络。炎症相关酶、炎症介质、细胞因子、黏附因子等在炎症过程中都发挥着重要作用，特别是 IL-1和TNF-α等，对炎症反应起重要调节作用[16]。抑制促炎因子是否能促进伤口的愈合，仍值得进一步深入探索。