芍药苷对慢性阻塞性肺疾病的疗效分析

谭 丹 曾小琴 徐 伟 周人杰

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)，是一种以气流持续受限、进行性肺功能下降为主要特征的常见慢性呼吸系统疾病，其主要的临床表现有咳嗽、咯痰、胸闷、气喘，甚至呼吸困难等[1-2]。严重影响患者正常的工作、生活以及社交活动，甚至导致患者劳动力的丧失，使患者的生存质量直线下降，危害人类的身心健康，给家庭和社会都造成了沉重的负担。近年来，随着全球人口老龄化的加剧，COPD的发病率及病死率呈逐年上升趋势，其引发的经济负担也随之持续上升，预计到2020年，COPD将会占到世界排名前3位的死亡原因之一[3-5]。COPD的病理基础为炎症反复作用下，引起气道重塑的不可逆性[6]。目前认为，引起COPD发病最主要的危险因素是吸烟，因为香烟中的有害成分以及氧自由基，可损伤气管的上皮细胞、诱发肺内发生炎性反应等，从而进一步导致COPD的发生[7]。

Toll样受体(toll-like receptor, TLR)，作为介导天然免疫的一类重要模式识别性受体，其介导的相关信号通路在炎症发生、发展以及变化中均起着重要的作用[8-9]。不同的TLRs对应识别与其相关的病原分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，其中，TLR2主要为革兰阳性菌受体，识别对应配体，可进行信号传导并使核转录因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)活化，NF-κB活化后可启动白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等一系列的前炎性反应细胞因子发生转录表达[10]。目前，在西医西药中，尚缺乏能够有效阻止该病病情发展的理想药物和治疗方案。研究表明芍药苷(paeoniflorin, PF)具有抗炎、抗氧化等药理作用，但芍药苷在COPD领域中的研究却尚未见文献报道[11]。本文通过脂多糖联合烟熏的方式建立COPD大鼠模型，观察芍药苷对COPD大鼠的作用，并探讨其可能机制。

材料与方法

一、实验材料

72只SD雄性大鼠，体质量180～220 g范围内，均来自重庆医科大学的SFP级实验动物中心，许可证编号为：SCXK(渝)2012-0001。芍药苷：纯度≥98%，批号20161203，成都曼思特生物科技股份有限公司；孟鲁司特钠：批号20160804，四川大冢制药股份有限公司。脂多糖：批号092M3，美国Sigma 公司；五牛牌香烟：烟气中一氧化碳(CO)含量为12 mg，焦油含量为11 mg，烟气烟碱含量为0.8 mg川渝中烟工业有限公司。ELISA试剂盒：R&D公司(美国)；成像系统：HITMAS-30(日本)。

二、研究方法

将72只大鼠采用“随机数字表法”随机分为6组：正常对照组(A组)，COPD模型组(B组)，芍药苷低、中、高剂量组(分别为C组、D组、E组)，西药组(F组)。其中，芍药苷低、中、高组剂量分别为10、25、50 mg /kg；西药组给予孟鲁司特1.0 mg/kg[12]。将除正常对照组以外其余各组的大鼠全部放进烟熏箱中，12只/箱，用透明胶带，将2只大号漏勺的凹面朝内进行固定(注意：尽量不要遮住网眼)，放置香烟(第1次放8支，之后每次放10支)，再将香烟尾部用透明胶带固定于漏勺的手柄位置，点燃香烟，将漏勺用筷子固定于烟熏箱顶部的活动门位置，随后关闭活动门，箱内大鼠被动吸烟，30 min/次[13]。造模周期共计52 d，第2～8天、第23～24天、第26～28天对各组大鼠均不做处理，以便大鼠体力恢复。其中，烟熏分为3阶段：第1阶段，每天烟熏1次(第9～22天和第29～36天)；第2阶段，每天烟熏2次(第37～44 天)；第3阶段，每天烟熏3次(第45～52天)，烟熏时间、次数总计： 22 d每天1次，8 d每天2次，8 d每天3次。脂多糖气道注射总计2次，分别为第1、25天，脂多糖注射具体步骤如下：先用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，随后仰位固定大鼠、备皮、消毒、沿纵向切开颈部皮肤、分离皮下的组织、将气管暴露，四号针头进行气管穿刺，缓慢注射0.1%的脂多糖200 μl。注射完毕后，立马直立大鼠，将其左右旋转，以促使脂多糖可于肺中进行均匀的分布，完毕后进行皮肤缝合、消毒，最后放在温暖鼠笼中待其清醒，清醒后再将其放回原鼠笼中。正常对照组第1、25天分别气道注射等值生理盐水且不予被动吸烟。造模成功后，于第2天开始给予相应药物剂量进行灌胃，其中正常对照组给予等值生理盐水，1次/d，连续给药30 d。

在处死大鼠前，观察并记录各组大鼠毛发状况、精神状态等相关情况，并计算大鼠的体质量增长量，体质量增长量=处死前体质量-初始体质量。应用肺功能检测仪测定各组大鼠肺功能相关指标，肺顺应性(lungcompliance, CL)、第0.3秒的用力呼气容积(forced expiratory volume 0.3%, FEV 0.3%)与用力肺活量(forced vital capacity, FVC)的比值、用力呼气流量(maximum midexpiratory flow, MMEF)。

取各组的肺组织，分别提取其总蛋白，采用聚丙烯酰胺凝胶(10%)进行电泳，结合说明书，进行试验，检测TLR2和NF-κB的表达，最后采用ECL试剂盒进行显影、成像[14]。每组实验均需重复3次。

按照ELISA试剂盒中说明书指示的相关操作步骤进行，分别检测血清和肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的表达水平；肺组织中相关指标的测定，先离心、得到上清液后，再按照试剂盒步骤进行检测。

三、统计学分析

结 果

一、各组大鼠的一般情况

正常对照组大鼠毛发光滑且白皙，活动正常，精神状态较好，饮食较好，无咳嗽；COPD模型组大鼠毛发干燥且泛黄，活动较差，精神萎靡，饮食量减少，经常性咳嗽；给药组能明显改善COPD模型组大鼠的上述不良情况。

二、各组大鼠体质量增长情况

正常对照组大鼠体质量增长(82.11±8.47)情况较好，模型组大鼠体质量增长(43.22±5.35)明显欠佳，与模型组相比，给药组大鼠的增长情况有明显地改善(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠体质量增长情况

注：aP<0.05；bP<0.01，与模型组比较；cP<0.01，与正常对照组比较

三、各组大鼠肺功能情况

与正常对照组相比，模型组大鼠CL、FEV0.3%/FVC、MMEF均明显下降(P<0.05)；与模型组相比，给药组大鼠3项指标均明显升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠肺功能情况

注：aP<0.05；bP<0.01，与模型组比较；cP<0.01，与正常对照组比较

四、各组大鼠TLR2、NF-κB表达情况

与正常对照组相比，模型组大鼠TLR2、NF-κB表达水平均增加(P<0.05)；与模型组相比，给药组大鼠可抑制其表达(P<0.05)，见表3，图1。

表3 各组大鼠肺组织TLR2、NF-κB蛋白表达情况

注：aP<0.05；bP<0.01，与模型组比较；cP<0.01，与正常对照组比较

五、各组大鼠炎症细胞因子表达情况

与正常对照组相比，模型组大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明显增加(P<0.05)；与模型组相比，给药组大鼠这几项炎症因子均明显减少(P<0.05)，见表4。

与正常对照组相比，模型组大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明显增加(P<0.05)；与模型组相比，给药组大鼠上述几项炎症因子均明显减少(P<0.05)，见表5。

图1 各组大鼠TLR2和NF-κB表达的wb图

与正常对照组相比，模型组大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明显增加(P<0.05)；与模型组相比，给药组大鼠上述几项炎症因子均明显减少(P<0.05)，见表6。

表4 各组大鼠血清中炎症细胞因子表达情况

注：aP<0.05；bP<0.01，与模型组比较；cP<0.01，与正常对照组比较

表5 各组大鼠BALF中炎症细胞因子表达情况

注：aP<0.05；bP<0.01，与模型组比较；cP<0.01，与正常对照组比较

表6 各组大鼠肺组织中炎症细胞因子表达情况

注：aP<0.05；bP<0.01，与模型组比较；cP<0.01，与正常对照组比较

讨 论

COPD是呼吸内科的常见疾病，可直接对患者肺部功能造成影响，造成患者发生咳嗽、气短、咳痰等临床症状，进而累计全身，造成病情反反复复，引起肺功能的不断恶化，逐渐合并各种心肺等相关并发症，严重影响患者的生活质量，威胁人类的健康[15-16]。COPD具有起病较缓慢、病程较长、病情重等特点，若不及时干预或干预不当，将诱发全身性炎症，伴随全身各大靶器官的损伤，极易导致呼吸衰竭等。由于COPD的高患病率及高致死率，给家庭和社会造成巨大的负担，预计到2020年，COPD将成为位居于世界疾病所造成经济负担排名的第五位，且现COPD发病率正呈逐年上升趋势，情况不容乐观[17]。目前，COPD，这种以气流被阻塞为特点的慢性支气管炎及肺气肿，其发病机制尚不完全明了，研究表明COPD是由多种炎症细胞、因子一起参与的慢性气管炎症性疾病[18-19]。现今普遍认为气道、肺血管及肺实质的慢性炎症是COPD的特征性病理学改变，在COPD的发病中有着重要的意义。巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞等激活后，可加速释放IL-8、TNF-α等多种炎症因子，其中，IL-1β和TNF-α作为众多炎症因子中较为重要的炎症介质前因子，可刺激IL-1、IL-6、IL-8等其他炎性介质的分泌，这些炎症递质可形成复杂的网络系统，进一步不断刺激分泌性的炎症介质渗出、中性粒细胞溶酶体的释放和氧自由基的生成，再反馈的促进单核巨噬细胞释放TNF-α和IL-1等，而TNF-α在气道炎症形成时，可加速中性粒细胞活化的进程，导致大量中性粒细胞沉积于气道黏膜，进而促使肺组织中的炎症细胞发生聚集、浸润，并造成在肺组织内损伤和修复不断反复地交替进行，导致气流不可逆性受限及肺泡壁损坏、肺组织纤维化及气道结构发生重塑[20-21]。此外，TNF-α的过度表达也会导致炎症反应发生时，患者肺组织损毁的进一步加重[22]。而IL-1β、IL-1、IL-6、IL-8等指标，特别是IL-1β是在炎症的初始到炎症的持续进程中都存在的炎性细胞因子。研究发现，气道中IL-1β也可反映患者气道中是否存在固有炎症，且IL-1β的表达在COPD的稳定期及急性加重期表达更多[23]。同时，有研究显示，IL-1β在COPD患者中表达增加也是造成患者病情进一步加重的原因之一[24]。故想要缓解COPD症状，延缓COPD的进程，抑制炎症因子的释放现已成为研究的热点和方向。

TLRs作为一类新近发现的细胞表面受体，可感知病原体并可激活细胞从而产生非特异性免疫，它也是连接非特异性和特异性免疫的纽带[25]。当微生物突破机体的屏障时，TLRs可以识别微生物，并激活机体，产生免疫应答。同时，在调控炎症反应方面，TLRs信号通路的作用也是受到公认的。TLRs受到刺激后，可活化干扰素通路、NF-κB通路等。NF-κB作为免疫应答中重要的蛋白调节因子，也有着非常重要的作用。

关于COPD的防治方式多种多样，对于COPD的急性期，主要使用支气管扩张剂、抗生素和全身使用糖皮质激素等进行治疗，而稳定期的患者则采取长期使用支气管扩张剂和糖皮质激素吸入进行维持治疗，但临床提示效果不是很满意。然而，相对于现代西医西药治疗而言，中医药疗效较为突出，有一定的优势。目前虽然对于COPD有不少中医药相关研究，但大多深度不够，仅局限于探讨下游零散的相关因子，对机制研究甚少[26]。芍药属于芍药科植物，主要存在于温带地区，是我国主要的药材之一，主要的活性成分包括单贴苷类、鞣质、酚类和一些黄酮、酸、烷、挥发油、氨基酸、蛋白质等化合物，这些有效成分主要存在于芍药苷中，其药理作用多种多样，应用也比较广泛。现中医药大量研究已证明芍药苷具有抗炎、抗氧化等药理学作用，但以往关于芍药苷抗炎的研究主要涉及颈椎间盘、肾组织、脑组织等，也有对狼疮小鼠肺损伤保护作用的研究，但对COPD的研究却是一片空白。本实验采用烟熏+气管内给予LPS的方法建立大鼠COPD模型，以芍药苷作为研究药物，进行了一系列初步探索。通过观察大鼠一般情况、测定肺功能，发现芍药苷可改善COPD大鼠毛发干燥、活动较差、精神萎靡、饮食量减少、经常性咳嗽、体质量增长欠佳等一般情况，还可提升大鼠肺顺应性(CL)、第0.3秒的用力呼气容积和(FEV 0.3%)和用力肺活量(FVC)的比值、用力呼气流量(MMEF)，从而改善COPD大鼠的肺功能，对COPD大鼠肺功能具有一定的作用；同时，通过ELISA法检测血清、肺泡灌洗液和肺组织中IL-1、IL-6、IL-8等炎症细胞因子的表达，结果与正常对照组相比，模型组大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明显增加(P<0.05)，与模型组相比，给药组大鼠这几项炎症因子均明显减少，说明芍药苷可缓解炎症因子的释放；通过Western blot检测肺组织中TLR2和NF-κB的表达，结果与正常对照组相比，模型组大鼠TLR2、NF-κB表达水平均增加(P<0.05)，与模型组相比，给药组大鼠可抑制其表达，说明芍药苷可抑制两者的表达。通过以上实验结果推测，芍药苷对COPD的作用可能是调控TLR2/NF-κB的通路。从而抑制下游炎症因子释放引起的。这为治疗COPD提供了新的思路。但本实验研究也存在一定的不足，影响下游炎症因子的通路很多，不止这一条，本实验只能初步说明芍药苷对TLR2/NF-kB通路可能会有影响，故在后续研究中，尚需加入通路相关拮抗剂作进一步深入研究。