普拉格雷对海水吸入型急性肺损伤的作用分析

鱼高乐 韩璐瑶 高永恒 宋斯迪 金发光

淹溺是近年来意外死亡的重要原因，与淡水相比，海水由于其高渗与碱性的特点，造成的急性肺损伤更容易出现严重的低氧血症与酸中毒，更易发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)，其救治难度更大[1]。海水淹溺的基本病理改变是肺微血管通透性增高，血管内液外渗，从而导致的肺水肿以及肺间质以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润[2]。

近年研究发现血小板除在凝血方面的作用外，在免疫炎症反应以及肿瘤转移中有着重要的作用。比如血小板可以与炎症细胞黏附，激活炎症细胞；血小板诱导内皮细胞黏附分子的表达，从而增加炎症细胞的黏附与渗出；血小板释放趋化因子以及可溶性免疫介质如CD 40 L，从而促进炎性细胞的激活与渗出[3- 5]。其中，血小板与中性粒细胞有着重要的相互关系，黏附于中性粒细胞与内皮细胞的血小板可促进中性粒细胞的迁移、黏附、渗出，同时血小板可以分泌炎性介质从而促进中性粒细胞释放活性产物[6-7]。

抗血小板治疗在一些炎症性疾病中有着不错的治疗以及保护作用，比如对酸吸入型肺损伤、脓毒血症及内毒素型肺损伤[8- 9]。普拉格雷通过抑制血小板表面的P2Y12受体，可抑制血小板活化与聚集反应，降低炎症反应[10-11]。研究表明普拉格雷可以通过抑制血小板与中性粒细胞的黏附达到降低炎症反应，从而对疾病产生保护作用[12]。鉴于海水吸入型肺损伤与炎症反应以及中性粒细胞的密切关系，本文旨在探索普拉格雷对海水吸入型肺损伤的作用以及可能的作用机制。

材料与方法

一、实验材料

健康雄性SD大鼠，清洁级，体重300 g左右，由空军军医大学实验动物中心提供。采用完全随机方法将64只SD大鼠分为两大组，即海水吸入后1 h与2 h组。每个大组中随机分又为四组，每组8只大鼠，分别为；A:空白对照组，B：海水淹溺组，C：溶剂CMC-Na预处理组，D：普拉格雷预处理组。造模前4 h灌胃给药。

普拉格雷购自Macklin公司，用0.5%羟甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose, CMC-Na)溶液混悬灌胃给药。配方海水按照中国国家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我国东南沿海海水的主要成分配制：NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，NaBr 0.083 g/L；pH 8.2，相对密度1.05，渗透压1300 mmol/L。TNF-α、IL-1β和TXB2 ELISA试剂盒购于Bio-Swamp公司。肺泡灌洗液蛋白测定使用Bradford试剂盒，髓过氧化物酶(MPO)试剂盒购于南京建成公司。测定流式细胞所用红细胞裂解液购于BD公司。流式抗体抗大鼠CD62P-PE抗体购于BIO-RAD公司，抗大鼠CD11b-APC抗体以及抗大鼠CD61-FITC抗体购于BD公司。

二、实验方法

C组给与2 ml/kg CMC-Na溶剂，D组给与3 mg/kg普拉格雷(0.5% CMC-Na混悬)，B、C、D组大鼠制作海水吸入型肺损伤模型，建模后1 h或2 h后放血处死大鼠后收集肺组织标本。动物模型的制备：大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(1.5 ml/kg)麻醉，仰卧固定于平板，大鼠头部垫高与桌面约呈30°，正中切口暴露气管，取1 ml的注射器插入气管，在4 min之内缓慢匀速注入4 ml/kg海水。

心脏穿刺取血对血小板的活化影响最小。用枸橼酸钠抗凝，在大鼠胸骨左侧偏下摸得心脏跳动最强点，用5 ml注射器呈大约20°夹角进针，有落空感后抽取血液3 ml。处死大鼠后，迅速打开胸腔，充分暴露气管、支气管，结扎右总支气管，防止灌洗液流入右肺。行气管插管，向左侧缓慢注入PBS，三次共计5 ml，回收率大于90%。

三、检测指标

1. 肺组织病理切片染色： 取大鼠右肺中叶组织，迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察。

2. 肺组织湿干比(W/D)测定： 取大鼠右肺下叶，擦干外表面后迅速称得其湿重，后将标本放于60 ℃烘箱中72 h称得干重，求出湿干比。

3. TNF-α、IL-1β和TXB2的测定： 心脏穿刺取血后血液离心后获得血浆，用ELISA法测得其细胞因子含量，操作方法严格按照试剂盒说明书。

4. 肺泡灌洗液蛋白测定及MPO测定： 肺泡灌洗液离心后取上清，蛋白测定按照Bradford试剂盒严格操作，MPO测定按照试剂盒步骤操作，之后比色计算结果。

5. 血小板活化率及其与中性粒细胞黏附率测定： 用抗CD11b抗体标记中性粒细胞，用抗CD61抗体标记血小板，CD62P为血小板活化指标。取心脏穿刺所得血液100 μl于流式管中，避光孵育30 min后裂解，洗涤，重悬后上机检测。流式细胞结合前向散射光、侧向散射光及标志性荧光抗体圈出中性粒细胞和血小板，进而分析血小板活化率以及血小板与中性粒细胞黏附率。

四、统计学方法

结 果

一、病理学检测

空白对照组大鼠肺泡结构清晰，未见明显的病理结构变化；海水处理组与溶剂预处理组大鼠肺组织结构紊乱，局部肺不张，肺间质可见出血、水肿，并可见大量炎症细胞浸润，肺泡间隔明显增厚；普拉格雷预处理组大鼠肺组织结构尚清晰，间质水肿、出血和炎细胞浸润等改变较海水处理组与溶剂预处理组大鼠明显减轻，并且海水吸入2 h较1 h病理损伤更为严重，见图1。

二、 肺组织湿干比、细胞因子测定

海水吸入后，肺组织湿干比明显增高，炎症因子TNF-α、IL-1β和TXB2也明显增高，2 h较1 h增高更为明显。普拉格雷预处理有效的降低了这些指标，见图2。

三、BALF蛋白测定、MPO测定

海水吸入后，肺泡灌洗液蛋白定量以及MPO活性也明显增高，同时2 h增高更为明显。普拉格雷预处理组这些指标均降低，见图3。

图3 不同处理组肺泡灌洗液蛋白浓度及MPO活性的比较；注：*表示P<0.05；n.s.表示无统计学差异；A：空白对照组；B：海水淹溺组；C：溶剂CMC-Na预处理组；D：普拉格雷预处理组

图1 不同处理组大鼠肺组织的病理切片，大鼠1 h与2 h肺组织的损伤；注：A：空白对照组；B：海水淹溺组；C：溶剂CMC-Na预处理组；D：普拉格雷预处理组(HE×20)

图2 不同处理组肺组织湿干比的比较，ELISA检测血浆TNF-α、IL-1β及TXB2水平；注：*表示P<0.05，**表示P<0.1，n.s.表示无统计学差异；A：空白对照组；B：海水淹溺组；C：溶剂CMC-Na预处理组；D：普拉格雷预处理组

四、血小板活化率及血小板与中性粒细胞黏附率测定

海水处理组与溶剂预处理组在海水吸入后血小板活化率以及血小板与中性粒细胞黏率均明显升高， 2 h较1 h两项指标升高更为明显，但普拉格雷预处理均有效的降低了血小板活化率及其与中性粒细胞之间的黏附，见图4。

图4 不同处理组血小板活化率以及血小板与中性粒细胞黏附率的比较；注：*表示P<0.05；n.s.表示无统计学差异；A：空白对照组；B：海水淹溺组；C：溶剂CMC-Na预处理组；D：普拉格雷预处理组

讨 论

海水吸入后进入肺泡腔的高渗海水可直接导致肺水肿的形成，并且损伤肺泡上皮和血管内皮细胞，使得肺内炎症渗出，肺泡结构受损、局部出现肺不张以及肺泡间质增厚、炎性浸润，出现通气换气障碍从而引起低氧血症。低氧血症与肺水肿又会不断加重炎症反应，形成恶性循环。同时多种炎症因子参与急性肺损伤的发生和发展，例如肺巨噬细胞激活后释放的血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)、TNF-α和IL-1 等以及活化的中性粒细胞与血管内皮细胞释放的氧自由基、血栓素、前列环素等炎症介质造成肺组织损害加重。炎症反应的级联放大进一步加重肺组织损伤[13]。故海水吸人后，极易出现急性呼吸窘迫综合征，如不及时诊治，病死率极高[14]。

近年来血小板在炎症免疫反应以及肿瘤转移方面的作用受到广泛关注，研究表明血小板可以直接识别、捕获、杀灭病原体，激活免疫细胞，促进炎症细胞黏附与渗出，调节炎症细胞的功能，例如增强其吞噬杀灭病原体以及产生中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)[15-18]。这些功能的实现部分原因是因为血小板可以分泌释放许多炎症介质以及其表面分子可以调节免疫细胞的功能[19]。许多研究表明血小板与中性粒细胞之间有着密切的关系，血小板除了具有促进中性粒细胞产生NETs外，还可诱导中性粒细胞脱颗粒，增强其吞噬作用，另外血小板作为产生循环型CD40L的主要细胞可促进中性粒细胞产生活性氧[20-21]。并且血小板可促进中性粒细胞趋化、黏附、渗出到炎症反应部位，血小板可以诱导内皮细胞上调表达黏附分子，聚集在内皮细胞上的血小板也可以介导炎症细胞的黏附与渗出[22]。许多疾病的发生与血小板有着密切的关系，例如血小板与免疫细胞的相互作用在多发性神经硬化中(multiple sclerosis, MS)对神经脱髓鞘产生重要影响，血小板的过度激活在糖尿病发生发展中也有着重要作用[23-24]。

血小板P2Y12受体在血小板活化中有着重要作用，其受体抑制剂可有效抑制血小板活化，使血小板前炎症反应因子释放减少，如CD40L。另外可减少血小板P选择素(selectin)的表达，而P选择素已被广泛证明可介导血小板与炎症细胞的黏附[11]。血小板P2Y12受体抑制剂包括氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)等，临床上在心血管疾病中有着广泛的应用，对血栓性疾病有着较好的防治作用[25-26]。另外使用该类药物进行抗血小板治疗对许多疾病可产生保护作用，比如对于肿瘤转移以及脓毒血症[27-28]。本文结果提示，P2Y12受体抑制剂普拉格雷可抑制血小板活化，减少血小板前炎症因子的释放，抑制血小板与中性粒细胞的相互作用，从而降低炎症反应以及中性粒细胞的渗出，对海水淹溺型急性肺损伤产生保护作用。实验结果证实普拉格雷对海水淹溺型肺损伤有较好的保护作用，有效改善了肺组织的渗出与水肿，而这一作用很可能是通过抑制血小板与中性粒细胞之间的黏附以及降低炎症反应实现的。但至于普拉格雷在降低血小板与中性粒细胞的黏附后是如何进一步影响中性粒细胞的趋化、黏附、渗出的，本实验缺少直接的证据，其具体机制需要进一步的探索与研究。有研究表明血小板与免疫细胞的黏附率与疾病的严重程度以及预后密切相关，如银屑病(psoriasis)、前列腺癌(prostatic carcinoma)等[29-30]。本文中2 h组肺损伤较1 h组明显加重，同时其血小板与中性粒细胞黏附率同时增高，因此可以进一步研究不同程度肺损伤与此指标的相关性，以期有助于疾病的诊断与严重程度评估。普拉格雷等抗血小板药物都会在一定程度上影响到凝血功能，因此也有必要在不同药物浓度梯度下，检测药物对肺损伤的保护作用以及血小板与免疫细胞的黏附率，争取用最小计量药物对肺损伤产生较好的保护作用，避免不必要的副反应。

综上所述，普拉格雷对海水淹溺型急性肺损伤有着较好的保护作用，可有效减轻肺组织损伤及炎性细胞浸润等。其具体的保护机制、最佳的药物剂量以及血小板与免疫细胞黏附率和疾病严重程度的相关性还需要进一步的探索研究。