多花黄精诱导愈伤组织与不定芽培养基筛选

叶雨心，任梦婷，易伟豪，齐 青，彭代银,2，邢世海,2

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012)

多花黄精Polygonatum cyrtonema是百合科黄精属多年生草本植物，其根茎为传统中药材。同属的黄精P. sibiricum、滇黄精P. kingianum亦做药用来源，以干燥根茎入药[1]。黄精始载于《名医别录》，列为上品，其功效 “主补中益气，除风湿，安五脏。久服轻身、延年、不饥”[2]。具有抗衰老、提高免疫力、调节造血、抗病原微生物、抗肿瘤、降血糖等药理作用，现临床应用于内科疾病、男性不育症、妇科疾病[3]。而黄精、多花黄精、滇黄精中以多花黄精质量最佳，因其外形似姜称为姜形黄精。多花黄精主产于安徽、贵州、湖南、浙江等省[4]，始载于《雷公炮炙论》，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效。其根茎中的主要化学成分为多糖和甾体皂苷。多糖具有免疫调节、降血糖、抗衰老、抗化学性肝损伤等作用，甾体皂苷具有降血脂、抗病毒、改善记忆障碍等作用[5]。

黄精可药食两用，故其市场需求量逐年上升，而野生黄精植物资源越来越少，不足以满足市场需求。多花黄精的传统繁殖方式有根状茎繁殖(无性繁殖)和种子繁殖(有性繁殖)，这两种繁殖方式所需时间较长[6]。与常规无性繁殖方法相比，组织培养繁殖可在短期内获得性状稳定的优良种苗。利用组织培养手段培育的种苗，除了保持母本的优良性状、增加繁殖材料、缩短育苗周期之外，还可以为建立优良苗圃繁育基地节省育苗成本。因此，开展多花黄精的离体组织培养和再生植株是有必要的[7]。刘红美等[8]建立了多花黄精组织培养快速繁殖体系，在前人基础上增加了生根、炼苗及移栽的系统性实验，认为在快速繁殖方面2,4-D相对于NAA更有利于多花黄精的不定芽诱导。周建金等[9]认为，利用多花黄精侧芽更容易诱导不定芽，并且变异度也相对较低。刘芳源等[10]认为，MS + 6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+ IAA 0.3 mg·L-1为最适的快繁培养基。本试验综合考虑多种植物生长调节剂及其浓度组合对多花黄精愈伤组织诱导的影响，采取正交试验设计选择最佳的愈伤组织培养基，同时筛选通过器官发生方式诱导多花黄精芽发生的适宜培养基，为建立完整的多花黄精组织培养体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 多花黄精根状茎。

1.1.2 试剂 6-BA、NAA、KT、2,4-D(上海源聚生物科技有限公司，批号070416、批号061212、批号070822、批号070605)；MS培养基(杭州木木生物科技有限公司，批号20170901)；蔗糖、琼脂、10%次氯酸钠、75%乙醇、脱脂棉购自国药集团。

1.1.3 仪器 立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号YXQ-LS-100S11)；净化工作台(上海三发科学仪器有限公司，型号SF-CT-2A)；接种器械灭菌器(上海咏星生物科技有限公司，型号JZ-160)。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒与接种 将多花黄精的根茎和带芽根茎洗净，剪去须根后用流动自来水冲洗30 min，备用。用无菌滤纸擦干后，在超净工作台上用10%次氯酸钠浸泡10 min后，用无菌水冲洗3～5次，再用无菌滤纸擦干，切成0.5 cm2大小、0.2～0.3 cm厚度的组织块接种到培养基上，每一个激素配方接种12瓶，每瓶接种3～4块外植体材料。

1.2.2 正交试验设计及培养基和培养条件 选取 6-BA、NAA、2,4-D、KT，每种生长调节剂设 3个浓度水平(表1)。选用L9(34)正交设计，以愈伤组织的产生率为指标，考察4种植物生长调节剂对多花黄精愈伤组织诱导的影响。培养基均加琼脂粉6 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，pH 5.5～6.5。高压蒸汽灭菌锅0.1 Mpa压力121 ℃温度下，进行高温高压灭菌30 min。培养条件为光照12 h·d-1，光照强度1600 lx，培养室温度25 ℃。培养15 d后，观察污染情况和愈伤组织诱导情况；培养40 d后，统计污染率和愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率=形成愈伤组织外植体数/接种后未污染外植体数×100%。不同培养基配方的愈伤组织诱导率必须除去污染的材料，方可体现出该培养基配方的诱导效果。

1.2.3 最佳培养基验证试验 以正交实验筛选的最佳生长调节剂组合的培养基配方接种多花黄精的根茎和带芽根茎组织块，外植体块大小、清洗方式和消毒方法同上，接种60瓶，每瓶接种3块外植体。培养基灭菌处理措施、接种材料培养条件同上。培养15 d后，观察污染情况和愈伤组织诱导情况；培养40 d后，统计培养材料的污染率和愈伤组织诱导率，分析并验证筛选的最佳愈伤组织诱导培养基配方的效果。

表1 植物生长调节剂种类及其浓度(mg·L-1)Table 1 Plant growth regulators and their concentrations

1.2.4 器官发生方式的芽诱导培养 使用三种不同的培养基配方：(1) MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1、(2) MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.2 mg·L-1、(3) MS + KT 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1，将多花黄精的根状茎外植体接种在培养基上，每种培养基配方接种12瓶，每瓶接种3块外植体，培养条件同上，培养20 d后观察芽诱导效果，统计芽诱导率。芽诱导率=形成芽外植体数/接种后未污染外植体数×100%。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导

诱导培养15 d后外植体形成愈伤组织(图1: A)。培养40 d后愈伤组织诱导的统计结果如表2。方差分析表明，6-BA、KT、NAA和2,4-D对多花黄精愈伤组织诱导效果较显著(F=7.88 ＞ F0.01=6.59)，极差分析表明，4种植物生长调节剂作用强弱依次为 KT ＞ 2,4-D ＞ NAA ＞ 6-BA，各生长调节剂的最佳浓度分别是 1.0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.1 mg·L-1、2.0 mg·L-1，即对于多花黄精愈伤组织诱导的最佳培养基为 MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ KT 1.0 mg·L-1。

2.2 愈伤组织诱导最佳培养基验证

在正交试验获得的最佳培养基上接种60瓶共180块外植体，培养15 d后，有42块外植体污染，未污染的外植体部分出现愈伤组织；40 d后污染外植体达47块，污染率26.11%，未污染的材料有45块形成愈伤组织，愈伤组织诱导率为39.10%，筛选的该培养基配方的愈伤组织诱导率明显高于试验设计中安排的各培养基配方，表明该培养基配方适用于多花黄精愈伤组织诱导。

2.3 器官发生方式的芽诱导

在芽诱导方面，培养基 MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.2 mg·L-1和 MS + KT 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1中未形成不定芽。培养基 MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1则成功地通过器官发生途径形成了不定芽，芽诱导率 66.7%(图 1:B)，该培养基是通过器官发生方式诱导多花黄精芽形成的较为适宜的培养基。

图1 多花黄精愈伤组织(15 d)与不定芽(20 d)诱导Fig. 1 Callus and adventitious buds induction of Polygonatum cyrtonema

3 讨论

研究表明，6-BA对黄精愈伤组织生长有显著效果[11—12]；万学锋等[13]也认为6-BA比其他细胞分裂素更有利于多花黄精的分化。本研究表明，细胞分裂素 KT对多花黄精愈伤组织的诱导有显著影响，6-BA对多花黄精愈伤组织的诱导作用不显著，与前人研究结果略有不同，但与2,4-D等生长调节剂配合使用有一定的促进效果。说明多花黄精愈伤组织的诱导对生长调节剂的要求可能不同；另外，本研究选择的生长调节剂组合有所不同[11]，而这些生长调节剂之间可能存在相互作用。

李莺等[14]发现，黄精根茎及地上嫩茎较叶片更容易诱导产生愈伤组织；裴莉昕等[15]的研究则认为，黄精嫩叶为诱导愈伤组织的最佳外植体。本研究用多花黄精的根茎作为外植体同样诱导出愈伤组织，且诱导效果较好。

陈松树等[16]以多花黄精的叶片为外植体，认为愈伤组织诱导最佳培养基为：MS + 6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 4.0 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1，与本研究采用根状茎为外植体诱导愈伤组织的培养基配方有较大差异，可见不同种类的外植体由于分化程度、生理状态、内源激素含量等差异，导致愈伤组织诱导时要求的植物生长调节剂及其组合也有较大的差异。

刘红美等[8]认为，MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.2 mg·L-1较适合多花黄精丛生芽的发生。在本研究的器官发生芽诱导中，该培养基未见芽的形成，可见器官发生方式直接成芽和诱导丛生芽的发生都是成芽过程，但属于不同的芽再生方式，对植物生长调节剂的需求存在一定的差异。

综上所述，本研究中，诱导多花黄精愈伤组织的最佳培养基配方为MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ KT 1.0 mg·L-1, 愈伤组织诱导率可达39.10%；培养基MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1可作为通过器官发生方式诱导多花黄精直接成芽的合适培养基。