响应曲面优化超声波辅助提取无花果叶总黄酮的工艺研究

苏适，王双侠

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061）

无花果叶是桑科植物无花果（Ficus caricaL.）的叶片，我国拥有极为丰富的无花果种植资源，分布在我国中部、西北部、南部省份，有很高的营养价值。无花果叶中含有黄酮、糖类、果胶、单宁、维生素C 及微量元素等化学成分[1-2]。临床研究表明，无花果叶提取物具有抗肿瘤、降血脂、抗氧化、抑菌和降血糖等作用[3-5]。无花果叶中含有大量的黄酮类化合物，黄酮具有很多药理作用，能预防心血管疾病、抗骨质疏松、治疗腹泻、清除氧化自由基、降血脂、治疗咽喉肿痛和调节免疫等作用[6-8]。

目前提取黄酮常用的传统提取方法有醇提法、双水相提取法、水蒸汽蒸馏法等[9-11]，成本低、便于操作，但费时、提取率偏低。近年来超声提取法在中草药的提取中应用较多，此法利用超声波的空化效应和机械效应，破坏植物组织，加强总黄酮的溶出和扩散，将植物中的化学成分快速提取出来，从而提高产物的提取率[12]。与常规溶剂提取法相比，超声辅助提取方法具有操作简单方便、效率高，溶剂使用量少，耗时短，提取液杂质少等特点，已广泛用于天然植物有效成分的提取。因此，本试验利用超声辅助法对无花果叶总黄酮的提取工艺进行优化，并结合响应面试验设计优化法确定最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无花果叶：市售，制成粗粉。

芦丁标准品（纯度98%）：中国药品生物制品检定所；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝（分析纯）：国药试剂有限公司。

1.2 试验仪器

KQ-50B 超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；101C-2B 电热鼓风干燥箱：上海市实验仪器总厂；XV-9200 紫外分光光度计：北京市精密仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 无花果叶总黄铜的提取工艺流程

无花果叶粉末→粉碎（过40 目筛）→乙醇浸泡→超声辅助提取→提取液→浓缩→干燥→无花果叶总黄酮提取物。

1.3.2 标准曲线

精确称取芦丁对照品10.0 mg，加乙醇溶解并定容，配制成浓度为0.10 mg/mL 的芦丁标准溶液。采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[13]，用紫外分光光度法在波长510 nm 处测定梯度浓度溶液的吸光度，得到无花果叶总黄酮的线性回归方程为：Y=0.012x-0.009，线性相关系数R2=0.997 3，由数据可分析得出标准品具有良好的线性关系。

1.3.3 提取率计算

取单因素试验项下及响应面试验项下的提取物，加乙醇溶解，并定容至50 mL 于容量瓶中，按1.3.2 项下方法测定其吸光度，并根据回归方程，计算无花果叶总黄酮浓度，进而计算提取率。

式中：C为测得浓度；V为定容体积；F为稀释倍数；M为原料质量。

1.3.4 单因素试验

称取无花果叶粗粉，采用超声法：辅助提取总黄酮，各单因素变量分别设置为：超声时间（20、30、40、50、60 min）；超声功率（100、200、300、400、500 W）；乙醇体积分数（20%、30%、40%、50%、60%）；料液比[1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）]，分析各因素对提取率的影响。

1.3.5 响应面试验设计

根据单因素试验，选取液料比、超声时间、乙醇体积分数、超声功率4 个影响显著的因素，根据Box-Behnken Design 中心组合设计原理，以总黄酮提取率为响应值，优化提取条件，因素水平见表1。

表1 响应面试验设计Table 1 Design of response surface experiments

1.4 数据处理

采用Origin7.5 和Design-Expert 8.0 软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 超声时间对提取的影响

超声时间对无花果叶中总黄酮的提取率影响如图1所示。

由图1可知，总黄酮提取率随着时间的延长逐渐上升，在40 min 时达到最大值。分析原因可能是随着超声时间的延长，超声波产生的空化作用和机械震动的持续作用下，加速无花果叶中黄酮向溶剂中溶出。但随着提取时间的继续延长，总黄酮的提取率呈下降趋势，在溶剂中超声时间过长使组织中大量细胞破裂，部分黄酮发生反应导致化学结构被破坏，同时也会增加部分杂质的溶出[14]，最后造成总黄酮总提取率下降。因此，超声时间选择30 min～50 min 进行Box-Behnken 试验设计。

2.1.2 超声功率对提取率的影响

超声功率对无花果叶中总黄酮的提取率影响如图2所示。

图1 超声时间对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoids

图2 超声功率对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of total flavonoids

由图2可知。黄酮类物质的提取率随着超声强度的增大而提高，其原因是超声强度越大，超声波所产生的破碎效应和热效应越明显，能够促使细胞壁破裂，无花果叶胞内的黄酮类物质的溶出加速。但超声强度达到400 W 后，继续增大超声功率黄酮类物质的提取率反而逐渐减少，其原因可能是超声强度过高，超声波的机械作用增强，产生的热量过多，造成某些黄酮物质的结构破坏[15]，致使总黄酮提取率下降。因此，超声功率选择200 W～400 W 进行Box-Behnken 试验设计。

2.1.3 乙醇体积分数对提取率的影响

乙醇体积分数对无花果叶中总黄酮的提取率影响如图3所示。

图3 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

由图3可知，提取率随着乙醇浓度的增加而增加，但当乙醇体积分数达到50%后，再增加乙醇体积分数，提取率反而下降，可能是乙醇浓度不断增大会使脂溶杂质、色素和糖类等物质大量溶出，而影响黄酮类化合物的溶出，使黄酮类化合物的提取率降低[16]。因此，乙醇浓度为30%～50%进行Box-Behnke 试验设计。

2.1.4 料液比对提取率的影响

料液比对无花果叶中总黄酮的提取率影响如图4所示。

图4 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由图4可知，提取率随着提取溶剂的量的增多而呈上升趋势，但料液比大于1∶60（g/mL）时总黄酮的提取率出现下降。可能是无花果叶粉末在溶液中的分散程度也增大，接触面积增大，有利于黄酮的提取；但当料液比超过1∶60（g/mL）时因为大量溶剂用会吸收一定的超声波产，增加了超声波破碎细胞的阻力，降低了细胞的破碎程度；也可能是因为溶剂体积过大时传质过程受到影响，导致提取率下降[17]。因此，料液比选择1∶50（g/mL）～1∶70（g/mL）进行Box-Behnken 试验设计。

2.2 响应面结果分析

2.2.1 响应面设计及结果

响应面设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计方案Table 2 Response surface test design scheme

2.2.2 响应面的建立与分析

采用Design-Expert8.0.6 软件对表2数据分析，得到二次回归拟合方程Y=3.48+0.13A-2.5×10-4B+0.18C+1.750×10-3D+0.025AB-0.076AC+0.052AD-0.024BC-0.057BD+0.041CD-0.27A2+1.967×10-3B2-0.34C2-0.23D2

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

续表3 方差分析表Continue table 3 Variance analysis table

由表3可知，P＜0.000 1，说明回归模型方程极显著，即建立的模型有意义；失拟值P=0.320 5＞0.05，没有显著差异，说明回归方程与试验拟合良好，试验误差小；确定系数R2=0.981 3，调整系数R2Adj=0.962 6，说明模型方程与试验拟合程度好，可用此模型对无花果叶总黄酮提取条件进行分析及预测。回归方程各项方差分析表明，回归模型一次项A、C为模型极显著因素，二次项A2、C2和D2为模型极显著因素，交互项AC为模型显著因素，其余各项对无花果叶总黄酮得率影响均不明显。各因素对提取率的影响作用：C＞A＞D＞B。

2.2.3 响应面分析

响应曲面图可以显著反映各因素之间相互作用的强弱，采用Box-Behnken 软件进行分析，结果如图5所示。

响应曲面越陡峭，则表明该因素对总黄酮得率的影响越大，响应值对于操作条件的改变越敏感，反之，曲面越平缓则影响越小；等高线能反映各因素间交互作用强弱，椭圆形说明两因素交互作用显著，而圆形则反之。由图可知，超声时间和乙醇体积分数曲线陡峭，说明二者相互作用对总黄酮提取率的影响极显著；超声时间与料液比的交互作用对总黄酮提取率的影响不显著，表现为曲线较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应值无显著性变化。等高线图中，其线性呈椭圆或趋向椭圆，表明对总黄酮提取得率影响显著，呈圆形则不显著。

图5 各因素交互作用对无花果叶总黄酮提取量影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on total flavonoids yield of ficus carica leaves

2.2.4 验证试验

结合单因素试验，分析回归模型，经过验证，最终得出该提取方法是准确可靠。无花果叶总黄酮的最佳提取条件：乙醇体积分数43.85%、超声时间41.8 min、料液比1∶60.85（g/mL）、超声功率200 W，理论预计值3.522%。结合试验实际情况，最终选择乙醇体积分数43%、超声时间42 min、料液比1∶60（g/mL）、超声功率200 W，进行3 次平行试验，得到总黄酮提取率平均值为3.519%，与预测值接近，验证了此模型的有效性，说明预测模型与实际情况拟合较好。

3 结论

根据响应面法优化无花果叶总黄酮提取条件，得出超声波辅助法提取总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数43%、超声时间42 min、料液比1∶60（g/mL）、超声功率200 W，进行3 次平行试验，在此条件下无花果叶总黄酮的提取率可达3.519%。与传统提取工艺相比，该提取工艺时间短，提高了总黄酮得率，为无花果叶的开发及利用提供了理论依据。