反相高效液相色谱法测定土荆皮药材中土荆皮乙酸含量的再探究

隋友乐 朱爱军(通讯作者)

264002中国人民解放军第一0七医院健康管理中心，山东 烟台

土荆皮(Cortex Pseudolaricis)药材系松科植物金钱松的根皮和近根树皮的干燥品，性辛温，其醇提物临床上用于治疗手足真菌感染、湿疹、神经性皮炎等[1]。研究表明，土荆皮药材中的二萜酸类是其发挥抗真菌、抗肿瘤、抗生育作用的主要有效成分[2，3]，其中以土荆皮乙酸的(PAB)含量最高、活性最强[4]。本文探究了土荆皮药材中土荆皮乙酸的反向高效液相色谱含量测定方法，与已报道的方法相比，该方法的优势有两方面[5-6]：①采用了超声波提取法处理供试品，与经典的回流提取法相比更方便快捷且提取温度更低，干扰物质提出少且测得含量明显高于报道值；②采用了乙腈-水作为流动相，在实验过程中我们发现采用该流动相分离效果明显优于甲醇-水洗脱系统。

仪器与试药

高效液相色谱仪：LC-10AT；超声波清洗器：KQ-500E 型医用；电子天平：AB135-S；土荆皮乙酸标准品：购自中国食品药品检定研究院；土荆皮药材；乙醇、乙腈、甲醇、丙酮均为色谱纯，水为超纯水。

含量测定

色谱条件：色谱柱：InersilRODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水-三氟乙酸(500:500:1)；流速1.0 mL/min；柱温室温；检测波长260 nm；进样量20 μL。在此色谱条件下[7]，土荆皮乙酸与提取物中其他组分有较好的分离度。对照品与供试品的保留时间一致(9.87 min)，对照品以及供试品的色谱图，见图1。

图1 高效液相色谱图(t/min)

溶液制备：①供试品溶液制备：精密称取土荆皮药材粉末0.456 74 g，置于25 mL 烧杯中，加水5 mL，浸泡2 h，加入90%乙醇10 mL，超声波提取20 min，过滤，甲醇洗涤(5 mL×3)，合并滤液、洗涤液，转移至100 mL容量瓶中丙酮定容，即得。②对照品溶液的制备：精密称取干燥过的土荆皮乙酸对照品5.31 mg，置100 mL 容量瓶中，甲醇定容，摇匀，精密吸取1 mL 置10 mL 量瓶中甲醇定容，得浓度5.31 μg/mL的对照品溶液。

线性关系考察：分别精密吸取供试品溶液制备项下储备溶液0.5 mL、1 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 置 于10 mL量瓶中用甲醇定容，分别得到2.66 μg/mL、 5.31 μ g/mL 、 21.24 μ g/mL 、42.48 μ g/mL、53.10 μg/mL 对 照 品 溶液。按色谱条件项下色谱条件测定，以浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标进行线性回归，得回归方程：Y=0.29×10-3X-0.16×10-3，r=0.999 6。证明土荆皮乙酸在进样浓度2.66～53.1 μg/mL范围内线性关系良好。

稳定性试验：取“对照品溶液的制备项”下供试品溶液，按“色谱条件”项下色谱条件在0、2、4、6、8 h各进样1 次，记录峰面积，RSD 2.12%(n=5)，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

重复性试验：精密称取同一批样品6份，每份约0.45 g，按“对照品溶液的制备”项下供试品溶液制备方法处理，精密吸取20 μL，按照“色谱条件”色谱条件测定，记录峰面积，按照“线性关系考察”项下的标准曲线计算测得量。土荆皮乙酸的测得量分别为7.88、7.78 μg、7.26 μg、8.08 μg、7.82 μg、7.97 μg，RSD 3.34%(n=6)，表明方法重复性良好。

精密度试验：精密吸取土荆皮乙酸对照品溶液(5.31 μg/mL)按“色谱条件”项下色谱条件重复进样6 次[8]，20 μL/次，纪录峰面积。结果：RSD=1.35%(n=6)，表明仪器精密度良好。

加样回收率试验：精密称取已知含量的土荆皮乙酸的土荆皮9份，加入土荆皮乙酸对照品溶液10 mL，按照“对照品溶液的制备”项下方法处理，测定含量，并计算回收率，结果平均回收率98.69%，RSD=1.58%(n=9)，表明本方法回收率良好。

表1 样品中土荆皮乙酸的含量

样品含量测定：样品提取率测定按照“溶液制备”项下制备供试品溶液，按照“色谱条件”中的测定，记录峰面积，利用线性方程计算土荆皮乙酸的含量(mg/g)，见表1。

讨 论

供试品制备方法的选择：和药典及报道的供试品制备方法相比，本实验选用了提取效率更高的超声波提取法，在提高检测效率同时，可有效避免高温对土荆皮乙酸的破坏[9]。

色谱条件的选择：为能在适宜的分析时间内获得目标成分的完全分离，在实验过程中首先尝试了甲醇-水洗脱系统，发现用该流动相洗脱时基线不平稳，分离度较差，故尝试了以乙腈-水-三氟乙酸作为流动相，发现在该条件下，基线平稳，待测组分分离良好，故最终确定用乙腈-水-三氟乙酸作为流动相。经考察，柱温考察了20～40℃范围内对分离度的影响不大，故选用室温。

本文对采用超声辅助浸提的方法制备土荆皮供试品，再探究了RP-HPLC法测定土荆皮中土荆皮乙酸的含量。测得土荆皮中土荆皮乙酸含量4.27 mg/g，RSD 3.34%，精密度实验RSD 值2.12%(n=6)，重现性实验的RSD 值3.34%(n=6)，加样回收率98.69%，RSD 1.58%(n=9)。实验结果表明，该方法的精密度、稳定性、加样回收率均满足测定要求。本研究为土荆皮的质量标准制定提供了依据，也为其深入开发利用提供研究基础。