MiR-101对胃癌化疗耐药的影响及机制

雷子颖 唐鸿生(通讯作者) 阮强 王佳泓 王进 黄永红

510095广州医科大学附属肿瘤医院腹部综合外科

胃癌是消化道中最常见的恶性肿瘤之一，其重要的生物学特征之一就是侵袭和转移，亦是胃癌患者死亡的主要原因。虽然随着临床诊断与治疗水平的提高，胃癌的治疗与诊断水平有了明显的提高，但是其恶性度高、易转移仍是导致胃癌患者死亡率高的重要原因。目前对于胃癌的治疗仍以手术为主，但尚有一部分患者因体质或胃癌分期较晚而无法选择手术，化疗是替代手术治疗的一种方法[1]。但部分患者存在对化疗药物无效及耐药的情况。miR-101 是近年来发现的一种对于肿瘤化疗耐药过程起作用的微小RNA，在多种恶性肿瘤中发挥类似抑癌基因作用，为探究其对胃癌化疗耐药的影响，特进行本次研究。

资料与方法

材料：本次研究所用到的主要试剂与材料是人正常胃黏膜上皮细胞GES1、人胃癌SGC7901 细胞系、胃癌耐药SGC7901细胞系(DDP细胞系)、特级新生小牛血清、实时荧光定量PCR 仪、细胞裂解液、TRIzolRNA 抽提试剂盒等。其来源统计，见表1。

方法：①细胞培养：采用人正常胃黏膜上皮细胞GES1、人胃癌SGC7901 细胞系、DDP 细胞系，细胞株培养在含有10%胎牛血清以及含1%青霉素和链霉素的RPMI-1640 细胞培养液中。细胞培养箱条件37℃，含有5%CO2。以下所有实验用细胞均取对数生长期细胞。②实时荧光定量PCR：用RNA 提取试剂盒提取细胞的总RNA，随后按照说明书进行逆转录。引物序列来自于南京建成生物工程公司。miR-101的序列为上游引物5'-GGCTCTGAGT- GGTTGAGC-3'、下游引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；cmet的引物序列为上游引物5'-TGAACTGCATACTACGCTCAAGA-3'、下游引物5'-CGGATTCGTCACAATGTGTTC-3'扩增条件按照说明书设置。其后对扩增产物进行检测，计算3组细胞系的相对表达量。③细胞转染：转染前1 d 以1×106/mL 接种生长至对数期的胃癌SGC7901细胞于6孔板，转染前先对细胞系进行饥饿处理1 h，并配备转染溶液(无血清培养基、转染试剂、质粒)并置于37℃温育15 min。将配置好的转染溶液缓慢滴注到6 孔板内，轻晃孔板后置于37℃温育5 h；祛除转染液后，继续将细胞培育于DMEM 液体培养基，孵育条件为5%体积分数的二氧化碳、37℃饱和湿度。比较转染前后DDP细胞的c-met的相对表达量。

表1 实验材料及来源统计表

统计学方法：本次研究所有数据，均采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，计量资料采用t检验，计数比较χ2检验，检验标准α=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

3 组 细 胞 系 的miR-101、c-met 的mRNA 表达情况：3 组细胞系的miR-101、c-met 的mRNA 相对表达量统计，见表2。

转染miR-101 及其抑制剂对胃癌SGC7901 细胞c-met 的表达影响：转染miR-101 前、转染miR-101 后及转染miR-101 抑制剂后c-met 的相对表达量，见图1。

讨 论

胃癌是消化道中最常见的恶性肿瘤之一，其占据农村癌症发病率的首位。胃癌恶性程度高，印戒细胞癌恶性程度尤其高，胃癌的侵袭和转移能力强，远隔脏器或组织的转移是导致胃癌患者死亡的最主要的原因。目前对于胃癌瘤体较大、患者基础体质差而不能耐受手术或患者不愿手术治疗的患者，多采取化疗的治疗方式。但在某些患者却存在对化疗药物耐受的现象，及对其他普通患者有效的化疗方案，却对这些患者的肿瘤不起作用。

表2 3组细胞系的miR-101、c-met的mRNA相对表达量统计表(±s)

表2 3组细胞系的miR-101、c-met的mRNA相对表达量统计表(±s)

细胞 miR-101 c-met GES1细胞 1.11±0.04⋆ 1.12±0.08#胃癌SGC7901细胞 0.62±0.04 1.57±0.10 DDP细胞 0.35±0.03 2.89±0.32注：GES1细胞的miR-101表达量与胃癌SGC7901细胞、DDP细胞相比，⋆P＜0.05，其中与DDP 细胞相比，P＜0.01；表示GES1 细胞的c-met 表达量与胃癌SGC7901 细胞、DDP 细胞相比，#P＜0.05，其中与DDP细胞相比，P＜0.01。

图1 转染miR-101及其抑制剂对胃癌SGC7901细胞c-met的表达影响

近年来的研究发现，miRNA 作为无编码的短小核苷酸链在机体内能起到调控基因含量与表达的作用；王莉莉通过RT-qPCR对口腔鳞癌病理组织中的miR-188 表达量分析发现[2]，miR-188 在口腔鳞癌组织中表达量显著下降。而其他一些miRNA 在肿瘤中的作用也相继被揭示开来。miR-101 是近年发现的一个肿瘤抑制miRNA，在多种恶性肿瘤组织中表达下调，在肿瘤发生、发展过程中具有类似抑癌基因作用。Guo等人对卵巢癌进行转染miR-101(miR-101 mimic)时发现[3]，转染后的卵巢癌细胞其穿膜细胞数及细胞增殖率明显减低，这提示miR-101 在对卵巢癌的增殖及转移方面起着较好的抑制作用。同时，孙海兵等人通过对比正常人与胃癌患者、胃癌化疗耐药患者的血清miR-101时发现[4]，胃癌患者的血清miR-101 明显低于正常人，而胃癌化疗耐药患者更低。Tian等报道，替莫唑胺耐药的胶质瘤细胞miR-101 表达下调[5]，过表达miR-101可通过抑制糖原合成酶激酶3β 逆转替莫唑胺的耐药性。c-met是一种耐药性基因，其耐药机制主要可能与PI3K信号通路相关联，研究表明抑制c-met表达可通过阻断PI3K/Akt通路，增强胃癌对顺铂的敏感性[6]。

在本次研究中发现，与正常胃黏膜细胞相比，SGC7901 细胞系、DDP 细胞系的miR-101的表达水平降低，而c-met表达水平升高，以DDP 细胞系更显著(P＜0.01)。随 后 笔 者 采 用miR-101 对SGC7901 细胞系进行转染处理，转染处理后SGC7901 细胞系的c-met 表达水平随之降低，再对这些细胞进行miR-101抑制剂处理，结果c-met 表达水平升高，且高于正常的SGC7901细胞系。

综上所述，miR-101 在人胃癌细胞中表达水平降低，而耐药性胃癌细胞表达水平更低，其低水平表达能降低对耐药相关基因c-met 表达的抑制而促使胃癌细胞对化疗耐药。