加味玄麦甘桔浸膏的抗炎祛痰抑菌作用

申玲玲，杜光

(华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，武汉 430030)

咽炎是临床常见病、多发病，表现为咽部异物感、梗阻感、干咳少痰、干燥、 灼热、发痒、微痛等症状。咽炎属中医学中的“喉痹”范畴，中医认为凡喉痹之病，不外乎热炽、阴伤两方面。急性咽炎多由上焦风热所致；慢性咽炎多由肺肾阴虚所致。

加味玄麦甘桔浸膏(XMGJ)由玄参、射干、麦冬、桔梗、甘草和开口箭等6味中药组成，具有清热解毒、泻火利咽等功效，常用于急慢性咽炎引起的咽喉肿痛等的治疗。该处方中君药为玄参和射干，有利咽功效，臣药是开口箭，有清热解毒功效；佐药是甘草和麦冬，具有养阴生津功效。前期笔者[1-2]对XMGJ提取工艺及质量控制做了相关研究，现对XMGJ治疗咽炎的疗效进行了初步药理学实验研究，包括抗炎、祛痰及体外抑菌实验，并对急性咽炎模型大鼠的血常规指标变化、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(IL)-1指标的影响进行了实验研究，进一步探讨XMGJ治疗咽炎可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1仪器 721型紫外-可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)；电子分析天平(METTLER TOLEDO公司，感量：0.1 mg)；高压灭菌锅(SS-325，日本TOMY公司)。

1.2实验药物 XMGJ的制备：将上述6种药材补足吸水量，加10倍量水浸泡1 h，煎煮3次，每次0.5 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至稠膏(1.15～1.20 g·mL-1，80 ℃)；阿司匹林(每片100 mg，拜耳制药公司)；复方草珊瑚含片(每片44 mg，江中药业股份有限公司)；二甲苯(化学纯，天津市北方天医化学试剂厂，批号：121204)；氨水(化学纯，天津市北方天医化学试剂厂，批号：121006)；TNF及IL-1试剂盒(北京东亚免疫技术研究所，批号：201228)。

1.3动物与菌株 昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，清洁级，华中科技大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2010-0009，SD大鼠，体质量180～200 g，雌雄各半，清洁级，华中科技大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2010-0009。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌由华中科技大学同济医学院附属同济医院提供。所有动物都按照严格的操作规范进行，所有实验进行时间为08：00-17：00。

1.4方法

1.4.1急性毒性实验 采用孙氏改良寇氏法测定半数致死量(LD50)[3-4]。昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组为10只。根据预实验结果，设计剂量为9.71～40.45 g·kg-1，各剂量间公比为r=0.7；实验前禁食不禁水12 h，灌胃给药，每天1次，连续7 d，记录小鼠给药后的毒性症状及死亡情况，并计算LD50。

1.4.2抗炎作用 ①二甲苯诱发小鼠耳肿胀。昆种明小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。根据LD50值XMGJ给药剂量设大、中、小剂量组，大剂量组为LD50的1/10即3.07 g·kg-1，中剂量为大剂量的一半即1.54 g·kg-1，小剂量为中剂量一半即0.77 g·kg-1，阿司匹林组(阿司匹林0.15 g·kg-1)，阴性对照组为0.9%氯化钠溶液(NS)组(0.15 g·kg-1)，均灌胃给药，每天1次，连续7 d。末次给药后1 h，将二甲苯0.02 mL涂于每只小鼠的右耳前后两侧，左耳作对照。4 h后将小鼠处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径6 mm打孔器分别在同一部位打下圆耳片，用精密扭力天平称质量。每只小鼠右耳质量减去左耳的质量即为肿胀度[4-5]。将对照组和给药组的肿胀程度进行统计学处理。

②棉球诱发肉芽肿。昆明种小鼠50只，雌雄各半，分组和给药量剂量与“1.4.1”项相同，阿司匹林组(阿司匹林0.15 g·kg-1)，阴性对照组为NS组(0.15 g·kg-1)。将(10±1)mg的棉球用青霉素和链霉素混合液0.2 mL浸泡，烘干，高压灭菌。用乙醚麻醉小鼠后，无菌条件在小鼠腹部作1 cm长的切口，用眼科镊子将棉球从切口处植入皮下，随即缝合皮肤。待小鼠手术麻醉醒后，灌胃给药，每天1次，连续7 d。第8天将小鼠处死，取出棉球肉芽肿，置于60 ℃烘箱内干燥12 h，称质量，减去原棉球质量即为肉芽肿净质量，计算肉芽肿质量[4-5]。

1.4.3气管段酚红法祛痰 昆明种小鼠50只，雌雄各半，分组和给药量剂量与“1.4.1”项相同，氯化铵组(氯化铵溶液0.15 g·kg-1)，阴性对照组为NS组(0.15 g·kg-1)，均灌胃给药，每天1次，连续5 d。末次给药前饥饿16 h，给药30 min后，腹腔注射5%酚红NS溶液0.5 mL。注射30 min后，处死小鼠，分离小鼠气管，用5%NaHCO3溶液1 mL进行冲洗，反复3次，合并3次冲洗液放置一定时间，取透明红色的上清液，用紫外分光光度计在波长546 nm处测定吸光度(A值)，以A值代表酚红排泄量与NS组进行统计比较[4，6]。

1.4.4急性咽炎 构建急性咽炎模型：用喉部喷雾器将25%氨水喷在大鼠的咽部，每天2次，上午下午各一次。每次喷3下(约0.5 mL)，连续喷3 d。第4天，将大鼠分组和给药，剂量与“1.4.1”项相同。复方草珊瑚组(复方草珊瑚含片4.8 g·kg-1)，阴性对照组给同体积的NS，均灌胃给药，每天1次，连续4 d。第7天，取5组大鼠股静脉血，测量血浆中血常规指标，血清中TNF及IL-1的含量[4-5]。

1.4.5二倍稀释法抑菌实验 XMGJ原液(1.00 g·mL-1)以巴多德法灭菌冷藏备用。以常见上呼吸道致病菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌为受试菌，在5 mL带塞灭菌试管中分别加入各菌种所需培养基2.0 mL，每种菌种各8管。按1～8编号，分别在第1管中加入XMGJ原液2 mL，混匀后取出2.0 mL放入第2管，采用二倍稀释法，依次将药液稀释成1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64系列溶液，即含药量分别为0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 5，0.015 6 g·mL-1。各管均加入浓度约为5×105CFU·mL-1的各病原指示菌菌液0.2 mL，同时分别设阴性对照管(含药液不含菌液)，阳性对照管(含菌液不含药物)。37 ℃培养箱中培养24 h后观察菌种生长情况。病原菌浓度计算方法：观察平板上的菌落形成单位(CFU)。<5 CFU·mL-1的浓度为抑菌浓度，标记“-”号，≥5 CFU·mL-1的浓度为无抑菌浓度，标记“+”，产生抑菌作用的最小浓度表示该管药量即是受试药的最低抑菌浓度(MIC)[4-5]。

2 结果

2.1LD50当XMGJ剂量达到13.84 g·kg-1时，小鼠开始出现死亡，死亡数是3，后面不同比例剂量(19.82，28.36和40.45 g·kg-1)对应的死亡数分别是3，4，5。通过计算得到LD50为30.71g·kg-1，结果显示XMGJ的毒性较低。

2.2对二甲苯引起的小鼠耳肿胀影响 XMGJ对二甲苯引起的耳肿胀结果见图1。大剂量组(3.07 g·kg-1)和中剂量组(1.54 g·kg-1)显著抑制了耳肿胀程度(P<0.01)。与阴性对照组比较，小剂量组(0.77 g·kg-1)对耳肿胀也有一定的抑制作用(P<0.05)。并且XMGJ对二甲苯所致小鼠右耳廓肿胀的抑制作用呈显著剂量依赖性。

与阴性对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.1Comparisonofearswellingamongfivegroupsofmice(n=10)

2.3对小鼠棉球肉芽肿形成的影响 XMGJ对由无菌棉球引起的肉芽肿实验结果见图2。大剂量组(3.07 g·kg-1)和阿司匹林组(阿司匹林0.15 g·kg-1)对肉芽肿的抑制作用相当，中、小剂量组对小鼠棉球肉芽肿形成也有抑制作用，并呈一定剂量依赖性。

2.4祛痰实验 XMGJ对小鼠酚酞祛痰实验结果见表1 。XMGJ不同剂量组均可增强气管酚红的排出。XMGJ最小剂量0.77 g·kg-1明显可以增加酚红排泌(P<0.05)。

2.5抑菌实验 XMGJ体外抑菌实验结果见表2。XMGJ对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌均有不同程度抑制作用，MIC值分别为0.031 5，0.031 5，0.015 6 g·mL-1。

与阴性对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.2Resultsofgranulomaformationinfivegroupsofmice(n=10)

表1 5组小鼠祛痰情况比较

Tab.1ExpectoranteffectofXMGJinfivegroupsofmice

n=10

与阴性对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group,*1P<0.05，*2P<0.01

表2 XMGJ体外抑菌作用

“-”：有抑菌作用；“+”：无抑菌作用

“-”：with bacteriostasis；“+”：without bacteriostasis

2.6血常规指标的变化 XMGJ对急性咽炎模型大鼠血常规的影响见表3。从表3可以看出，模型大鼠在XMGJ作用下，血浆中白细胞计数、中性粒细胞和淋巴细胞百分比含量与阴性对照组比较明显下降。

表3 5组大鼠的血常规指标比较

Tab.3Comparisonofbloodroutineexaminationamongfivegroupsofrats

组 别剂量/(g·kg-1)白细胞计数/(×109·L-1)中性粒细胞淋巴细胞%阴性对照组4.809.86±1.2324.62±5.5676.72±6.06复方草珊瑚组4.807.65±1.12∗130.49±3.35∗167.89±4.37∗1XMGJ 小剂量组3.078.75±1.08 ∗228.89±5.1771.02±4.37∗2 中剂量组6.147.46±1.13∗131.34±4.83∗169.65±4.45∗1 大剂量组9.216.32±1.12∗133.43±4.27∗165.14±3.52∗1

与阴性对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with negative control group，*1P<0.01，*2P<0.05

2.7血清中TNF和IL-1的变化 XMGJ对急性咽炎模型大鼠血清中TNF及IL-1水平的影响见表4。从表4可以看出复方草珊瑚组血清TNF、IL-1水平明显低于NS组(P<0.01)，XMGJ不同浓度组别的TNF，IL-1水平与NS组比较也较低(P<0.05，0.01)。

表4 5组大鼠血清中TNF及IL-1变化

Tab.4VariationoftheserumlevelofTNFandIL-1infivegroupsofrats

n=10

与阴性对照组比较，*1P<0.01 ，*2P<0.05

Compared with negative control group，*1P<0.01 ,*2P<0.05

3 讨论

玄麦甘桔汤是治疗咽喉肿痛的要药。方中甘草、开口箭清热解毒；射干、桔梗、玄参、麦冬利咽润肺化痰。诸药合用，共奏解毒化痰，利咽润肺之功。本研究从抗炎、祛痰和抑菌等药理模型入手初步探讨XMGJ治疗咽炎的作用机制。

炎症是机体局部组织受到损伤后所呈现的一种防御反应，根据持续时间不同分为急性炎症和慢性炎症两种。急性炎症以发红、肿胀、疼痛等为主要症候；慢性炎症多以增生、局部病变为主，其中肉芽肿性炎症最为常见。二甲苯所致耳肿胀急性炎症模型和棉球所致肉芽肿慢性炎症模型是经典的炎症模型。这两种动物模型常用于抗炎药物的筛选和评估。在二甲苯所致小鼠耳肿胀的血管渗透性急性炎症特性模型中，不同浓度的XMGJ均能显著减小二甲苯所致小鼠耳肿胀度，说明XMGJ有可能通过降低血管通透性，减少各种黏附分子和细胞因子从血管渗到周围的组织，从而达到舒缓咽炎的症状。在小棉球引起的肉芽肿实验中，不同组别的XMGJ明显抑制肉芽肿的生长，结果表明XMGJ可能通过抑制组织增生起到抗慢性炎症的作用。

咽炎病变主要在咽部黏膜层，除了伴有黏膜慢性充血，黏液腺肥大，黏膜及黏膜下层结缔组织增生，还有黏液分泌增多的症状。祛痰实验利用酚红能部分从气管排泌的特点，随着气管分泌量的增加，上呼吸道黏膜排出的酚红也增多，用分光光度计测出酚红的排泌量，从而可以得知药物祛痰作用的强弱。祛痰实验结果显示XMGJ能使小鼠气管段酚红排泌量显著增加，促进局部血液循环，增加腺体的分泌，显示XMGJ有较好的清咽利喉的功效。此外，细菌感染也是咽炎的重要致病因素之一，体外实验中XMGJ对呼吸道常见致病菌如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌均有一定的抑制作用。

目前研究还发现炎症细胞因子[7-8]在咽炎的发病机制中发挥重要作用。炎症细胞因子一方面可以促进血液血管内皮细胞白细胞粘附。另一方面可以使血管内皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞活化，增加血管通透性和刺激碱性成纤维细胞增殖和淋巴细胞增殖和分化。其中，TNF和IL-1又被称为前炎症因子[9]，是启动抗菌炎症反应的关键因子。TNF主要由活化的单核巨噬细胞产生，通过刺激血管内皮细胞表达黏附分子，让其粘附于白细胞，刺激巨噬细胞等分泌趋化性因子，引起白细胞在炎症部位的聚集。IL-1具有广泛的免疫调节作用，并伴有致热和介导炎症的作用[10]。它在炎症中主要作用是刺激单核巨噬细胞核内皮细胞分泌趋化因子，并促进其粘附；促进外周肌肉溶解；通过促进T细胞生长分化，使其数目增加并激活B细胞产生抗体，达到增强免疫和调节炎症反应的作用。由此可以看出，IL-1分泌增多时，炎症及免疫反应都会增强，有可能引起发热、体质量减轻及肉芽组织增生等。这些前炎症因子的活动有利于抑菌和排除细菌。在急性咽炎模型中，XMGJ通过急性炎症模型大鼠降低白细胞数、中性粒细胞和淋巴细胞含量而起到一定程度的抗炎作用。同时XMGJ还可以降低动物血清中TNF 和IL-1水平，从而抑制TNF引起的气道反应，以及激活内皮细胞黏附分子使中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等聚集，减少IL-1对血管内皮细胞的直接损伤，减少免疫黏附，促进内皮的修复。这可能是该浸膏发挥治疗咽炎作用的初步药理机制。但是XMGJ到底如何发挥其治疗咽炎的功效，还需进一步研究。