徐良额 何天阳 张丽 陆一丹 综述 罗聪 审校
近年来,全球恶性肿瘤的总体发病率呈现持续升高的趋势。据全球癌症流行病学数据库(Global Cancer Statistics,GLOBOCAN)和世界卫生组织国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)资料显示[1],到2018年,估计将有1 810万新增癌症病例和960万癌症死亡病例。其中,肺癌最常见的恶性肿瘤(占癌症总死亡人数的11.6%),是癌症死亡的主要原因(占18.4%),结直肠癌(占9.2%),胃癌(占8.2%)和肝癌(占8.2%)等消化道肿瘤紧随其后,严重威胁着人类的健康。目前临床上治疗恶性肿瘤主要以手术、化疗和放疗为主,但是都很难达到满意的疗效。近些年,抗肿瘤靶向药物在治疗多种恶性肿瘤方面取得了突破性的进展,使其成为了继手术、化疗、放疗后的一大新兴治疗方法[2]。但目前研制的靶向药物仍存在诸多不足,于2010年被美国FDA批准的曲妥珠单抗,虽然在Her2阳性乳腺癌中取得了成功,但对胃、食管肿瘤疗效却并不理想。同样,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂在多个胃、食管肿瘤的Ⅲ期临床试验中也被证实无效[3]。而CLDN18.2蛋白是一种高度特异、稳定地表达于多种恶性肿瘤细胞表面的靶点蛋白,与其特异性结合的claudiximab[又称为zolbetuximab或理想单克隆抗体362(ideal monoclonal antibody 362,IMAB362)]近期已被多项临床试验证实疗效显著,不良反应小且安全剂量范围较大[4]。笔者通过总结CLDN18.2蛋白的最新研究进展对其基本结构功能、在恶性肿瘤中表达情况、调节机制以及其特异性抗体研究等方面作一综述。
CLDN18.2蛋白是一种跨膜蛋白,属于Claudins(CLDNs)家族成员之一,其N端和C端均位于细胞内,整个蛋白表达于细胞膜上,是细胞紧密连接的重要结构成分(图1)。Claudins具有4个跨膜区、2个细胞外环及1个胞质内环,参与形成细胞之间的紧密连接结构。人类CLDN18基因的第一个外显子存在两个等位基因,可表达CLDN18.1和CLDN18.2两种不同的剪切突变体,导致包括细胞外环1在内的氨基端69个氨基酸序列的差异,故两者细胞外抗原表位存在差异。
图1 Claudins结构示意图
作为细胞间紧密连接结构的关键蛋白,CLDNs家族广泛分布于各种上皮组织,一种类型的上皮细胞往往可表达27个以上的CLDNs家族成员,这些CLDNs蛋白的正常表达确保每种组织精确调控特定的紧密连接功能。研究发现,CLDNs蛋白与上皮细胞维持渗透压、屏障功能以及细胞极性密切相关[5],且参与对病原体的免疫防御过程[6]。另外,CLDNs被证实在许多肿瘤的发生发展过程中存在表达模式的改变,将CLDNs谱系作为特异性标志蛋白的靶向治疗研究已得到广泛关注。尽管大部分的CLDNs广泛表达,但其中的个别成员如CLDN18蛋白往往高度选择性地表达于胃肠道等特定组织。CLDN18基因位于人第3号染色体的3q 22.3,其基因第一个外显子有两种选择,由此形成两种不同的剪切突变体,可表达出N端69个不同氨基酸序列的两种蛋白亚型,分别为CLDN18.1蛋白和CLDN18.2蛋白[7]。这段氨基酸的差异,可使CLDN18.2蛋白的抗原表位避免和CLDN18.1蛋白发生免疫交叉反应。其中CLDN18.1蛋白是肺泡上皮细胞选择性表达的特异性抗原,仅在正常肺泡组织中高度表达,而在其他正常组织包括胰管等组织均未发现[8];CLDN18.2蛋白也是一种具有高度选择性的标志蛋白,但其分布的组织与CLDN18.1蛋白完全不同。CLDN18.2蛋白在正常健康组织中表达高度受限,在未分化的胃干细胞并不表达,仅表达于分化的胃黏膜膜上皮细胞,且表达程度十分有限[4],有利于维持胃黏膜的屏障功能,可阻止胃酸中的H+经细胞旁途径发生渗漏[7]。然而,CLDN18.2蛋白在多种恶性肿瘤发生发展过程中频繁发生异常改变,如当胃上皮组织发生恶性转化时,细胞极性的紊乱将导致细胞表面的CLDN18.2蛋白表位暴露。同时,CLDN18.2基因也会出现异常激活,高度选择性、稳定地表达于特定肿瘤组织[9],参与肿瘤细胞的增殖分化和迁移,这使其成为潜在的抗肿瘤药物有效分子靶点。
CLDN 18.2蛋白是一种CD20样分化的蛋白,尽管在正常组织中表达高度受限,在多种原发性恶性肿瘤发生发展过程中往往出现异常高表达。CLDN18.2蛋白最初被发现能持续、稳定地高表达于多种胃癌组织[10],但随后研究表明,其也能在乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌以及非小细胞肺癌等多种原发恶性肿瘤中异常激活和过度表达,尤其好发于消化系统恶性肿瘤,包括胃癌(70%),胰腺癌(50%),食管癌(30%)等[11]。Wöll等[12]对胰腺的正常组织包括外分泌腺的导管细胞、腺泡细胞、泡心细胞以及内分泌腺的胰岛α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞和PP细胞等不同结构和不同的细胞类型进行了全面的检测,但均未检测到CLDN18.2蛋白。而在174例原发性胰腺肿瘤中,59.2%的患者肿瘤组织中CLDN18.2蛋白阳性的细胞≥1%,且绝大部分CLDN18.2阳性患者表现为高表达。胰腺神经内分泌肿瘤的患者CLDN18.2蛋白阳性率相对较低,25例患者中仅5例表达了CLDN18.2蛋白,阳性率仅20%,但该研究结果也有助于促进此类相对罕见疾病的靶向治疗的研究和发展。Micke等[13]通过免疫组化检测显示,正常肺组织和支气管黏膜上皮CLDN18.2蛋白表达阴性,但在非小细胞肺癌患者中CLDN18.2蛋白的阳性率为3.7%,尤其在肺腺癌中高度表达,且与其mRNA的转录水平相一致。CLDN18.2蛋白表达上调还可能与一些恶性肿瘤的癌前病变相关,Jovov等[14]发现,Barrett食管患者病变组织中CLDN18.2蛋白表达明显增高,与远端食管癌的发生密切相关,表明CLDN18.2异常激活可能是食管癌的早期事件。
CLDN18.2蛋白的表达并不局限于原发灶,在转移灶中也高度表达,可能参与恶性肿瘤细胞增殖和趋化转移的过程。Wöll等[12]发现,胰腺癌继发淋巴结转移或肝转移的患者中,CLDN18.2阳性率并不低于未发生转移的患者(淋巴结转移组、肝转移组和未转移组阳性率分别为70%、66%及59%),甚至部分患者淋巴结转移病灶中CLDN18.2蛋白的表达程度明显高于原发灶,故认为CLDN18.2的活化表达与淋巴结阳性者的不良预后呈正相关,淋巴结阳性是胰腺癌预后不良的独立因素。Jiang等[15]研究证实,胃癌转移性病灶与其原发性病灶的CLDN18.2表达水平表现一致,表明胃癌肿瘤细胞离开原发性病灶后CLDN18.2的表达水平无明显变化。CLDN18.2蛋白的过表达亦见于胃腺癌腹腔种植性转移灶,尤其是胃腺癌的卵巢转移,即Krukenberg肿瘤。目前,CLDN18.2蛋白促进恶性肿瘤的淋巴结转移和远处转移的机制并不十分清楚,可能与其异常表达改变了恶性肿瘤细胞间的紧密连接结构和功能有关[16]。
CLDN18.2基因序列在人及诸多哺乳动物中高度保守,但在肿瘤进展过程中其表达却容易发生改变,随着肿瘤逐步浸润其表达程度明显增加。CLDN18.2表达的调节机制仍未完全清楚,目前认为其表达主要受CLDN18.2基因编码序列中的低甲基化基因序列CpG岛启动子和转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)调节[17]。CLDN18.2的激活取决于转录因子CREB与CpG岛内的低甲基化位点的结合,CREB结合的位点为高度保守的TGACGTG序列,是位于CREB结合起始点至转录起始位点之间高度重复的核苷酸序列[18]。肿瘤细胞的cAMP激活蛋白激酶A(PKA)后,活化的PKA进入细胞核,通过氨基端激酶诱导域(KID)磷酸化来活化CREB,在被PKA磷酸化后,CREB的转录活性会增加10~20倍,结合CpG岛启动子引起CLDN18.2的异常激活和过表达。同时,DNA基因序列的去甲基化亦被证实能显著增加CLDN18.2的表达,表明CLDN18.2的调节也与DNA甲基化相关[19]。近期一项研究表明[20],在肺腺癌中miR-767-3p和CLDN18的表达呈负相关,miR-767-3p可通过结合其3'非翻译区(3¢-UTR)抑制CLDN18的表达,从而抑制肺腺癌细胞的生长、迁移和侵袭,但该研究未进一步揭示miR-767-3p对CLDN18.2的调节作用。
免疫耐受是恶性肿瘤细胞能够在机体内不断增殖、扩散甚至转移的重要机制之一,接种具有特异性的疫苗可打破机体免疫耐受包括B细胞耐受性,诱导CLDN18.2的特异性自身抗体产生。实验研究表明,CLDN18.2阳性的恶性肿瘤有希望通过免疫诱导的方式得到有效治疗。Koamp等[21]利用CLDN18.2的基因片段取代乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的pro-79和ala-80位点形成嵌合病毒样颗粒疫苗HBcAg-CLDN18.2-VLPs,并在老鼠和兔子两种动物活体内成功诱导产生多克隆抗体。这种嵌合VLP-based疫苗诱导产生高滴度的多克隆抗体被证实能够精确地识别并结合肿瘤细胞膜表面的CLDN18.2的抗原表位,但与CLDN18.1蛋白无免疫反应。与CLDN18.2结合的多克隆抗体主要通过抗体介导的细胞毒作用(antibody-dependent cytotoxicity,ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)等途径有效清除CLDN18.2阳性的肿瘤细胞。同时,VLP-based疫苗还可通过增强细胞毒性T细胞(CTL)介导的细胞免疫反应,提高机体抗肿瘤免疫。Jiang等[15]使用杂交瘤和人源化技术成功开发了人源化CLDN18.2特异性hu8E5和hu8E5-2I单链可变区片段(single-chain fragment variable,scFv),通过慢病毒载体转导制备可与CLDN18.2蛋白特异性结合的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CART),包含CD28共刺激结构域的hu8E5-28Z和hu8E5-2I-28Z CART细胞均能通过免疫介导的细胞毒作用裂解表达CLDN18.2蛋白的靶细胞,有效抑制CLDN18.2阳性异种移植小鼠模型体内的恶性肿瘤生长,但未见其对包括胃组织在内的正常器官存在明显的损害作用。特异性的免疫诱导治疗CLDN18.2阳性肿瘤,打破机体的肿瘤免疫逃避及免疫耐受,在未来可能有一定的研究及应用前景,但由于目前缺乏相关临床研究数据,其在人体内的安全性及有效性需要进一步的研究证实。
4.2.1 特异性单克隆抗体claudiximab结构及免疫功能claudiximab是来自嵌合了人类IgG1恒定区的小鼠的单克隆抗体,是由Ganymed制药公司研发的CLDN18.2蛋白特异性结合抗体[22],可由经基因重组后的中国仓鼠卵巢细胞表达产生。claudiximab能特异性识别、高亲和力结合CLDN18.2蛋白的细胞膜外第一个细胞外域(the first extracellular domain,ECD1),而不与任何其他Claudin家族成员结合,包括与CLDN18.2结构高度相似的剪接变体CLDN18.1。目前,claudiximab作为一种十分具有研究前景的靶向治疗药物,其安全性及有效性在前期动物试验中得到了证实,能有效地杀伤CLDN18.2阳性肿瘤细胞。claudiximab可诱导体外培养的CLDN18.2蛋白阳性的人胰腺癌细胞凋亡,其杀伤能力与肿瘤细胞表面CLDN18.2表达水平直接相关,联合使用化疗药物吉西他滨可上调人胰腺癌细胞CLDN18.2的表达,并增强其介导的ADCC作用[9]。通过claudiximab治疗,负荷CLDN18.2阳性的恶性肿瘤细胞株的老鼠有明显生存获益,减缓了肿瘤生长和转移[9]。另外,claudiximab与CLDN18.2结合形成的抗原-抗体复合物还可刺激活化分布于皮肤和黏膜组织上执行固有免疫功能的γδT细胞,活化的γδT细胞释放细胞因子INFγ、TNFα以及大量的趋化因子、招募相关免疫细胞参与抗肿瘤免疫反应,协助DC细胞识别和提呈抗原,并可直接通过细胞毒作用(通过死亡受体和细胞溶解的颗粒通路)和ADCC杀伤肿瘤,因而claudiximab对于黏膜相关的癌症治疗效果更为明显。
4.2.2 claudiximab临床研究 近年来,许多临床研究结果进一步证实了claudiximab单抗在CLDN18.2阳性肿瘤患者中的安全性及有效性。目前,claudiximab的临床研究主要集中于晚期胃食管癌患者的治疗。Schuler等[23]纳入了15例CLDN18.2阳性胃食管腺癌晚期患者,首次在人体内开展了I期临床研究,该研究结果提示人体对claudiximab有良好的耐受性。随后,另一项纳入28例化疗后CLDN18.2阳性胃食管腺癌患者的I期临床研究[24]报道,claudiximab与IL-2、唑来磷酸(ZA)联合使用时取得了比较满意的疗效,该研究中最终20例患者完成了评估,其中11例疾病得到了控制,10例病情基本缓解,1例获得部分缓解,无进展生存期为12.7周,总生存期为40周,而出现的常见治疗相关不良事件包括恶心和呕吐,大多为1~3级。通过进一步药代动力学分析发现[25],claudiximab在人体内平均半衰期为13~24天,300~600 mg/m2为推荐剂量范围,但单次剂量高达1 000 mg/m2时在难治性/转移性胃癌或胃食管癌的患者群体中仍具有良好的耐受性,未出现胃炎、溃疡或穿孔等黏膜损伤表现,这可能是由于正常分化胃黏膜细胞表达的CLDN18.2蛋白隐藏于紧密连接结构的超分子复合物中,使得血循环中的claudiximab未能有效与正常胃黏膜结合,但癌变后导致细胞极性混乱使CLDN18.2的抗原表位暴露于癌细胞表面,更容易受到claudiximab识别及特异性结合。claudiximab在机体内并不会降低CLDN18.2的表达,但与肿瘤细胞表面的CLDN18.2结合后可抑制肿瘤扩散,通过ADCC和CDC杀伤肿瘤细胞[26],激活FcR受体阳性细胞和补体因子等机制直接诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖[23]。另外,它可能通过干扰CLDN18.2在癌细胞中的生物学功能,从而产生抗肿瘤细胞增殖和促凋亡作用,其确切机制目前尚不清楚。与一线化疗药物联合使用时,其还可增强T细胞浸润并诱导炎症细胞因子释放,显著增强疗效[27]。
Trarbach等[28]在上述Ⅰ期临床研究基础上进一步开展Ⅱa期(MONO)临床研究,结果显示纳入研究的54例肿瘤晚期患者中,claudiximab药物的有效反应率为10%,疾病控制率为30%,证实了单用claudiximab药物在CLDN18.2阳性难治性胃食管腺癌患者体内具有较好的安全性和疗效。最新一项纳入739例胃食管癌患者的国际性、多中心、随机平行对照的Ⅱb期(FAST)临床研究[27,29]评估了claudiximab作为晚期/复发性胃癌和胃食管腺癌患者的第一线治疗药物的安全性及耐受性,发现claudiximab最常见的不良反应包括呕吐、中性粒细胞减少、贫血等,其中大多是NCI-CTC 1/2级,3/4级事件并未因为claudiximab而显著增加。同时,经claudiximab联合一线化疗药物EOX(表柔比星,奥沙利铂,卡培他滨)治疗后,CLDN18.2阳性的胃食管癌晚期患者PFS(中位数7.9个月vs.4.8个月;HR=0.47,P=0.000 1)及OS(中位数13.3个月vs.8.4个月;HR=0.51,P<0.001)显著提高。此外该研究还发现,与表达相对较低的患者比较,在CLDN18.2表达较高的患者群体中(≥70%肿瘤组织中其表达强度≥2+)claudiximab的疗效更为显著(PFS 7.2个月vs.5.6个月;HR=0.36,P=0.000 5;OS 16.6个月vs.9.3个月;HR=0.44,P<0.000 5)。由此可见,与早期临床试验中的胃食管癌标准化疗药物相比,claudiximab已显示出显著的疗效和安全性。Moran等[30]对298个GC/GEJ组织样本检测分析发现,CLDN18.2在胃癌/胃食管癌中的阳性率高达28%~30%,且与HER2重叠率为12%,claudiximab可能成为非常有应用前景的靶向治疗药物,希望正在进行的Ⅲ期临床试验能够提供更明确的答案。
随着靶向治疗疗效与基因分型相关研究的深入,靶向药物已成为恶性肿瘤个体化治疗和综合治疗的新选择,未来以基因表型为特征的个体化治疗方案会成为主流。靶向药物治疗恶性肿瘤的效果明显,可与放化疗联合应用提高疗效、降低耐药性。CLDN18.2因其高度选择、稳定地表达于特定肿瘤组织,成为了近几年抗肿瘤药物分子靶点研究的热点,有研究表明已有CLDN18.2靶向药物能有效地杀伤CLDN18.2阳性细胞,包括体外或体内人类胃癌细胞株。而目前Ⅱ期临床试验研究已确认CLDN18.2作为阳性晚期胃食管癌患者治疗靶点具有较高安全性、耐受性和活性。总体来说,目前的初步结果还是乐观的,但CLDN18.2靶向药物仍需要Ⅲ期临床试验进一步评估。随着靶向药物研究的不断进展,新的靶向药物的诞生会为恶性肿瘤的诊断和治疗带来新的希望,使恶性肿瘤患者具有更高的生存率。