TAZ促进胃癌中血管生成及相关机制的研究*

白婧如 赵秀兰 孙冉 张丹芳 刘铁菊 张艳辉 董学易 车娜 梁晓辉 程润芬刘爽

胃癌是全球第五大常见癌症，尽管随着诊断与治疗技术的不断提高，胃癌的发病率有所下降，但其总体预后仍较差［1］。肿瘤的新生血管为肿瘤细胞提供丰富的营养，在肿瘤的生长、侵袭、转移中发挥重要作用［2］。内皮依赖性血管是最为“经典”的血管生成模式，很多信号分子参与其形成的调控，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是较为明确的可以促进其形成的调控因子，而VEGF的分泌又受到多种因子的调控［3-4］。

β-catenin是典型Wnt通路的效应分子，广泛存在于内皮细胞、成纤维细胞等，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关［5］。β-catenin通常定位于细胞膜，参与细胞骨架的形成。在肿瘤细胞中，β-catenin表现为膜表达的缺失，其细胞核的异位表达激活Wnt信号通路，从而入核与不同靶基因结合，在肿瘤中发挥不同作用［6］。多项研究表明，β-catenin在多种肿瘤中可以促进VEGF的分泌，进而促进肿瘤血管生成［7-9］。

TAZ，又称为WWTR1（含有WW结构域的转录调节因子1），作为Hippo信号通路的关键下游效应分子，最初通过其与14-3-3蛋白质相互作用而被发现［10］。近期研究表明，TAZ作为一种转录共激活剂，在多种肿瘤中高度表达，发挥着不同的致癌作用［11-12］。此外，越来越多研究发现TAZ在血管生成中发挥重要作用［13-14］。

目前，TAZ在胃癌中的作用机制尚未明确，关于TAZ与β-catenin在血管生成中作用的研究仍较少。本研究旨在通过分析探讨TAZ在胃癌中的作用机制，为胃癌血管生成方面的研究提供新的见解。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集天津医科大学总医院和天津医科大学肿瘤医院2001年1月至2013年1月经手术切除后送检的胃癌标本150例，所有患者术前均未接受放化疗。

1.1.2 细胞株 人胃癌细胞系MGC803购自中国医学科学院基础研究所，MKN28购自江苏凯基生物技术股份有限公司，HUVEC细胞购自美国ATCC公司，293T细胞购自上海复旦大学中山附属医院。

1.1.3 实验试剂 DMEM、RPMI-1640和Opti-MEM培养基均购自美国Neuronbc公司，胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。慢病毒包装试剂盒和质粒均购自美国GeneCopoeia公司，TAZ过表达质粒（EXZ0976-Lv201），TAZ过表达对照质粒（EX-NEGLv201），TAZ降表达质粒（HSH017916-LvRH1GP），TAZ降表达对照质粒（CSHCTR001-1-LvRH1GP）均购自美国GeneCopoeia公司。Transwell小室购自美国FALCON公司，Matrigel胶购自美国Invitrogen公司。兔抗人TAZ抗体购自美国Abcam公司，兔抗人βcatenin抗体购自美国Abcam公司，鼠抗人CD34购自北京中山金桥生物技术有限公司，小鼠抗人GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司，二抗购自北京中山金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 石蜡包埋，切片，每片厚度5µm。切片经二甲苯脱蜡，无水乙醇脱苯后，用3%甲醇过氧化氢封闭内源性过氧化物酶30 min，之后95%乙醇-80%乙醇-无水逐级脱水，EDTA 9.0抗原修复液微波修复，血清封闭于室温20 min，滴加一抗TAZ（1：200）于4℃孵育过夜。次日用PBS液冲洗3次，滴加兔二抗孵育1 h后，DAB显色15 min，水洗，苏木复染细胞核，水洗，脱水透明，封片。

判定标准：采用Mattern积分法对免疫组织化学染色结果进行评分，每个标本在显微镜（×400）下，随机选取10个视野，分别记录标本的阳性细胞百分比及染色强度。阳性细胞百分比判定规则如下：阳性细胞＜25%为0分，25%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分。将染色强度按以下标准分为0～3级：无阳性着色为0，浅黄色为1级，黄色为2级，棕黄色为3级。最后通过染色强度与染色范围的乘积确定最终得分，＜3为阴性，≥3为阳性。

1.2.2 细胞培养 HUVEC、MGC803、293T及MKN28细胞培养：添加10%FBS、1%双抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素）的DMEM或RPMI-1640培养基。细胞均培养于37℃、5%CO2培养箱中。

1.2.3 细胞转染及建立稳转细胞系 常规方法培养293T细胞后，用含灭活血清培养基继续培养2～3 d，根据慢病毒试剂说明书添加试剂与TAZ上下调质粒，之后待293T细胞中观察到荧光颗粒后，收集病毒液，并做标记。将胃癌细胞传代于6孔板中，用含灭活血清的培养基培养24 h，然后按照转染试剂说明书添加相应试剂及病毒液，12 h后更换普通完全培养基。转染48 h后用荧光倒置显微镜观察转染效率，用嘌呤霉素进行药筛。

1.2.4 共培养及条件培养基的制备 HUVEC与肿瘤细胞共培养实验需要采用条件培养基（conditioned medium CM）。用上述稳定转染的肿瘤细胞在无血清培养基中饥饿培养24 h，然后用5%FBS培养基替代。取其上清液，1 000 r/min离心10 min去除细胞碎片，用0.22µm滤器过滤后即为条件培养基，于4℃保存。

1.2.5 Western blot法检测 将细胞裂解后提取的蛋白等量上样于10%聚丙烯酰胺分离凝胶中电泳，之后湿转90 min于PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h后，添加抗体TAZ（1：500），β-catenin（1：5 000），GAPDH（1：2 000），4℃孵育过夜。次日待恢复室温后回收一抗，TBST洗膜3次，添加相应二抗孵育1～2 h，洗膜3次后加发光液，避光显影，拍照。应用Image J软件分析蛋白条带。

1.2.6 Transwell迁移实验 实验用无血清培养基制备细胞悬液，并调整细胞密度至1×105个/mL。小室上层内加入200µL细胞悬液，下层内加入500µL含有血清的完全培养基，置于培养箱中培养24 h后用冷甲醇固定20 min，擦除上层细胞后用0.4%结晶紫染色，镜检，计数并统计数据。

1.2.7 三维培养 实验前将培养基与Matrigel胶1：1混合，添加40µL平铺于96孔板，放置培养箱中过夜。次日，消化细胞并重悬至1×105个/mL，将细胞悬液以200µL/孔加入到96孔板内，之后放入培养箱中培养，待显微镜观察成管后拍照计数。

1.2.8 MTT实验 实验按照试剂盒说明书进行，将培养好的96孔板于酶联免疫检测仪上，检测每孔490 nm的吸光值（OD），记录统计。

1.2.9 酶联免疫吸附试验（ELISA） 将转染后的胃癌细胞及其相应的对照组细胞提前无血清饥饿培养后，分别收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书按步骤操作，设计3个复孔，最后加入终止液反应30 min后，用酶标仪读取450 nm OD值。

1.3 统计学分析

上述实验均重复3次，采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料分析均采用t检验法，应用Kaplan-Meier法进行生存分析，并用χ2检验统计TAZ与临床病理资料的关系。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TAZ在胃癌中的表达

用免疫组织化学法检测TAZ、β-catenin在150例胃癌组织中的表达水平，结果显示TAZ主要表达定位于肿瘤细胞胞核内，β-catenin表达于细胞膜和细胞核中（图1）。150例胃癌组织中TAZ阳性表达率为43%，βcatenin阳性表达率为54.7%。此外，在TAZ阳性组中βcatenin阳性表达率为67.2%，在TAZ的阴性组中βcatenin阳性表达率为32.8%，β-catenin在TAZ阳性组中表达明显高于TAZ阴性组，TAZ的表达与β-catenin具有相关性，差异具有统计学意义（表1）。

通过免疫组织化学法用CD34对内皮细胞进行标记，采用t检验比较高表达TAZ组与低表达TAZ组微血管密度（microvessel density，MVD）计数。结果显示，高表达TAZ组MVD数量明显多于低表达TAZ组，TAZ的表达与MVD具有相关性（图2，P＜0.05）。

分析TAZ与150例胃癌患者临床病理资料的关系。结果显示，TAZ的表达与年龄、性别和肿瘤直径大小无关，而与肿瘤分级、TNM分期和远处转移及复发相关（表2）。此外，Kaplan-Meier生存分析结果表明，TAZ表达阳性患者较TAZ阴性患者的生存时间相对较短，差异具有统计学意义（P=0.028，图2）。

图1 免疫组织化学法检测人胃癌组织中TAZ与β-catenin表达情况（×200）

表1 TAZ与β-catenin的相关分析 例

表2 TAZ的表达与胃癌临床病理特征的关系 例

2.2 TAZ促进内皮细胞成管、增殖及迁移的能力

通过对共培养的内皮细胞进行三维培养，结果显示，内皮细胞与TAZ上调的MKN28细胞CM共培养后，成管能力较对照组明显增强，相反，内皮细胞与TAZ下调的MGC803细胞CM共培养后，成管能力较对照组明显减弱。

Transwell迁移实验结果显示，TAZ下调组的内皮细胞迁移数量少于对照组，而在TAZ上调组中，内皮细胞迁移数量明显较对照组增多，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

MTT实验结果见图4，TAZ上调组较TAZ下调组更有利于内皮细胞的增殖，TAZ上调后，内皮细胞的增殖能力明显增强，而下调肿瘤细胞中TAZ的表达，内皮细胞的增殖能力减弱。

图2 胃癌中TAZ与MVD的关系及生存分析图

图3 TAZ对内皮细胞管道形成能力及迁移能力的影响

2.3 TAZ表达升高增强胃癌细胞中β-catenin的表达

细胞免疫荧光结果显示，在MKN28细胞系中，上调TAZ的表达，β-catenin的表达也随之增强，而在MGC803细胞中，下调TAZ的表达，β-catenin的表达也降低。

Western blot结果与免疫荧光结果相一致，转染TAZ过表达质粒的MKN28细胞，与对照组相比，βcatenin的表达水平上升；转染TAZ降表达质粒的MGC803细胞，β-catenin的表达水平较对照组降低（图5）。

2.4 TAZ表达升高促进VEGF蛋白的表达

通过ELISA法检测MKN28（过表达TAZ或对照）和MGC803（下调TAZ或下调对照）中VEGF蛋白的表达情况。结果显示，MKN28细胞中TAZ的过表达与对照组相比，VEGF表达增加，MGC803中TAZ下调明显抑制了VEGF的表达（图6）。

图4 TAZ对内皮细胞增殖能力的影响；

图5 免疫荧光与Western blot检测TAZ与β-catenin的表达变化

图6 ELISA法对各组肿瘤细胞培养基中VEGF因子检测情况；*：P＜0.05

3 讨论

近年来，TAZ被发现在多种肿瘤中表达水平升高，如乳腺癌、肺癌、大肠癌和胶质瘤等，通过多条信号通路途径在不同的肿瘤中发挥着致癌作用。在Hippo通路激活后，TAZ被LATS1/2磷酸化，由此在细胞质中保持静止状态。相反，Hippo通路未激活或由多个内在和细胞外信号抑制其作用时，导致TAZ的去磷酸化和核定位［10，12］。有研究表明，TAZ在乳腺癌中高表达，上调TAZ促进乳腺癌细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、侵袭迁移及增殖等［15］。TAZ通过子宫内膜癌细胞中GAB2的中间体，从而进一步调节PI3K/AKT途径［16］。此外，高表达TAZ被发现存在于非小细胞肺癌中，且与其分化程度差、预后差、生存期短有关［17］。本研究中发现TAZ在胃癌组织中高表达，且与肿瘤分级、转移等相关。

大量研究表明，TAZ在调控血管生成中发挥重要作用［13］。在小鼠的视网膜中敲除YAP/TAZ基因，会导致小鼠视网膜血管发育缺陷［18］。YAP/TAZ还可以通过调节内皮细胞增殖和重排，从而促进新生血管的稳定性［19］。在肿瘤中TAZ通过Hippo、Wnt和GPCR等信号通路对肿瘤的分化、转移、生长和干细胞特性的维持发挥重要作用［20］。本研究通过免疫组织化学法用CD34对内皮进行标记，进行MVD计数。结果显示，TAZ蛋白在胃癌中的表达与MVD相关，提示TAZ可能在胃癌血管生成中发挥作用。在共培养后进行一系列细胞功能实验发现，内皮细胞与TAZ高表达的胃癌细胞共培养后，其成管、增殖和迁移能力得到促进。免疫组织化学法检测发现，在人体胃癌标本中β-catenin表达与TAZ表达具有高度相关性。

多项研究表明，β-catenin为Wnt信号通路中的关键因子并参与基因的调控。TAZ在细胞质中磷酸化状态能抑制Wnt/β-catenin靶基因的表达，而核TAZ脱磷酸化可激活Wnt/β-catenin通路［21］。来自大肠杆菌的脂多糖通过Wnt/β-catenin诱导的TAZ升高刺激人牙周膜干细胞的成骨分化［22］。当Wnt信号通路激活时，β-catenin向胞核内转移，从而与T细胞因子（transcription factor，TCF）等结合发挥作用［5］。活化的β-catenin易位至细胞核并与TCF复合以促进VEGFA的转录，表明Wnt/βcatenin信号传导调节血管形成［8］。此外，有研究表明，在VEGF启动子区域发现有TCF结合元件，进一步表明β-catenin对VEGF的表达存在一定的调控作用［9］。VEGF主要通过与其受体特异性结合，促使内皮细胞内的信号转导，微血管新生，最终形成新的肿瘤血管网［23］。本研究通过Western blot法和免疫荧光检测结果表明，TAZ的上调可以促进胃癌细胞中β-catenin的表达，相反，降表达TAZ后，β-catenin表达随之降低。此外，通过ELISA实验发现，在胃癌细胞系中上调TAZ的表达促进VEGF蛋白的表达。

综合上述，TAZ在胃癌组织中高表达，且TAZ通过与β-catenin的相互作用，促进VEGF的表达，进而促进内皮细胞的增殖和迁移。本研究从人体组织标本与体外细胞实验两部分探讨了TAZ在胃癌血管生成中的作用，证实了TAZ与β-catenin的相关性。此外，本研究对TAZ在胃癌发生发展中的调控作用进行探究，为胃癌血管生成方面的研究提供新的思路与见解。但是肿瘤血管生成是一个综合而复杂的过程，关于TAZ在胃癌中如何调控β-catenin的表达以及相关通路的相互作用亟需进一步的研究。