番茄SlWDR204基因正调控植物干旱胁迫

张琳 李欢欢 于淑坤 黄曼 苗敏

摘要为了进一步研究SlWDR204的功能，克隆了番茄的SlWDR204基因，通過亚细胞定位为研究其功能提供线索，并通过农杆菌介导法，利用RNAi技术获得SlWDR204基因下调的转基因植株。干旱胁迫试验表明，转基因番茄对干旱胁迫更加敏感，说明SlWDR204基因正向调控植物对干旱的响应，这一发现为分子育种提供了新的靶标基因，并为阐明植物抗旱的分子机理奠定了基础。

关键词SlWDR204基因;WD40家族蛋白;转基因番茄;抗旱性

中图分类号S188文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）01-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.030

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

植物由于固着生活的特点而不可避免地会受到环境不利因素的胁迫，这些胁迫包括生物的和非生物的，其中非生物的胁迫因素包括干旱、高温、低温、重金属离子等[1]。干旱胁迫是植物胁迫中重要胁迫之一，干旱对作物的生长发育造成了不可逆转的影响，严重影响了作物的品质和产量[2]。

WD40家族蛋白在动植物中均有发现，但其生物学功能有较大差别。WD40蛋白一般具有一个保守的结构域WD40-repeat，一般含有6～8个WD40-repeat，每个repeat由40～60个保守的氨基酸构成，其N端和C端分别有高度保守的二肽GH（Gly-His）和WD（Trp-Asp）[3]。番茄WD40（WD40-repeatdomain）基因家族编码100多个番茄SlWDR（WD40-repeatdomainfamilymembersintomato）蛋白[3]。前人研究表明，WD40家族蛋白作为CUL4-DDB1泛素连接酶复合体与底物直接结合而发挥作用[4]，参与包括果实发育、胁迫应答、抵抗病害等许多重要生理过程[5-6]。而WD40家族蛋白成员SlWDR204蛋白参与紫外胁迫应答和紫外修复，是生物体中核苷酸切除修复通路的重要元件[7]。为了进一步研究SlWDR204的功能，笔者克隆了番茄的SlWDR204基因，通过亚细胞定位为研究其功能提供线索，并通过农杆菌介导法，利用RNAi技术获得SlWDR204基因下调的转基因植株，并对转基因植株进行干旱胁迫，发现转基因番茄对干旱胁迫更加敏感，表明SlWDR204基因正向调控植物对干旱的响应，以期为阐明植物抗旱的分子机理奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂番茄（Solanumlycopersicum）、大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α菌株、农杆菌（Agrobacterium）GV2260菌株、质粒表达载体，反转录试剂盒、pfuDNA聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、MS（MurashigeandSkoog）、6-BA（6-Benzylaminopurine）、IAA（indole-3-aceticacid）、KT（Kinetin）、2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyaceticacid）、ACE（Acetosyringone）、KANA（Kanamycin）、SB（Carbenicillin）。

1.2番茄SlWDR204基因的克隆根据SolGenomicsNetwork中SlWDR204基因（Solyc09g031610.2.1）序列信息，设计SlWDR204-F和SlWDR204-R的特异性引物。

提取番茄野生型幼苗总RNA，反转录为cDNA，通过DNA聚合酶链式反应PCR扩增SlWDR204基因，PCR条件如下：预变性95℃4min;变性温度95℃2min，退火温度58℃20s，延伸温度72℃100s，72℃5min，30个循环。

1.3SlWDR204的亚细胞定位亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞中的具体存在部位，例如存在核内、胞质内或细胞膜上，GFP是绿色荧光蛋白，在扫描激光共聚集显微镜下可以发出绿色荧光，可以准确定位蛋白质在细胞中的位置[3]。构建SlWDR204-GFP融合表达载体，该表达载体可由35S强启动子启动。构建成功的表达载体转入农杆菌，筛选阳性菌株。采用烟草基因瞬时表达体系表达番茄基因SlWDR204。将经过乙酰丁香酮诱导的农杆菌转入烟草叶片中，SlWDR204-GFP经过36h表达，该蛋白经过表达得到一定的积累。经处理后的烟草叶片，利用激光共聚焦显微镜观察番茄SlWDR204表达蛋白的亚细胞定位。

1.4番茄SlWDR204-RNAi转基因植株的获得与鉴定用液氮冷激法将SlWDR204-RNAi重组质粒转入农杆菌中，筛选获得阳性克隆菌株。利用组织培养的方法，获得野生型植株的愈伤组织。采用经乙酰丁香酮诱导处理后的农杆菌侵染番茄愈伤组织，利用组织培养的方法培养，经共培养、筛选分化、生根等步骤，培养至幼苗[8]。经过炼苗后，移栽至土中培养，筛选获得阳性转基因植株。

1.5干旱胁迫试验为了探究番茄SlWDR204基因对干旱胁迫的抵御能力，使用生长状况相同的番茄SlWDR204-RNAi转基因植株和野生型植株进行试验。将番茄转基因种子和野生型种子播种于土中，种子萌发暗处理3d，待种子露白，置于光下生长，光照18h、黑暗6h，温度26℃。待番茄生长至幼苗，将番茄幼苗移栽至花盘中培养。待花盆中土壤吸水饱和后，将转基因植株与野生型植株进行干旱胁迫处理，观察番茄植株叶片失水枯萎情况。

2结果与分析

2.1番茄SlWDR204基因分析番茄SlWDR204基因所编码的蛋白质长度为587aa，该基因定位于番茄的第9号染色体上，由10个内含子和11个外显子构成，位于9号染色体的中部位置，番茄SlWDR204基因具有一个特殊DWD功能模块，DWD模块拥有125个氨基酸的保守结构域，其所编码的蛋白质含有多个保守的WD（Trp-Asp）、D（Asp）以及R（Arg）重复氨基酸序列（图1A）。番茄SlWDR204基因所编码的蛋白质与拟南芥WD40家族同源基因所编码的蛋白质具有较高的同源性，存在不同数量的重复保守氨基酸序列，如WD（Trp-Asp）（图1B）。

2.2SlWDR204基因的克隆提取番茄野生型幼苗总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，所得的PCR产物进行核酸琼脂糖凝胶电泳，番茄SlWDR204基因的长度为1608bp，PCR产物的电泳结果见图2，电泳结果显示，所得条带大小位于1000～2000bp，与原基因大小1608bp位置一致，测序结果显示基因序列正确。

2.3SlWDR204的亚细胞定位将带有SlWDR204-GFP融合表达载体的农杆菌注射烟草的下表皮细胞，36h后用激光共聚焦显微镜观察番茄SlWDR204表达蛋白的亚细胞定位。之前的研究显示番茄WD40家族SlWDR13、SlWDR25以及SlWDR28等基因的蛋白表达定位细胞核中[5]，推测番茄SlWDR204表达蛋白也定位细胞核中。亚细胞定位试验结果显示，GFP蛋白表达定位在细胞核和细胞质中，故而在整个细胞中都呈现绿色，SlWDR204表达蛋白主要定位于细胞核（图3）。

2.4转基因番茄的鉴定通过农杆菌介导转化和植物组织培养技术，获得SlWDR204-RNAi转基因番茄。收取部分转基因番茄叶片样本，提取番茄叶片中的基因组DNA。植物表达载体pBI121含有NPTⅡ基因，使用NPTⅡ引物对番茄转基因植株进行阳性鉴定（图4），获得10株番茄转基因阳性苗。

2.5番茄SlWDR204转基因植株干旱胁迫后的植株形态试验发现，干旱胁迫8d时，SlWDR204-RNAi转基因植株的部分叶片开始出现轻度失水，干旱胁迫13d时，SlWDR204-RNAi转基因植株的所有叶片都出现严重失水，叶片全部呈现枯萎状态;而野生型植株叶片在干旱胁迫8d时，叶片呈平展状态，干旱胁迫13d时，部分叶片呈失水枯萎状态（图5）。该试验表明，SlWDR204基因有助于提高番茄植株的抗旱能力。

3结论与讨论

利用农杆菌侵染番茄愈伤组织获得SlWDR204基因下调的番茄转基因株系。通过观察发现SlWDR204番茄转基因株系长势比野生型茂盛，分支较野生型多，说明SlWDR204基因对番茄生长发育存在一定的影响。同时对转基因番茄进行干旱胁迫试验。通过干旱胁迫试验观察野生型与SlWDR204-RNAi转基因番茄叶片失水情况，发现野生型番茄的抗旱能力明显优于SlWDR204-RNAi转基因番茄，确定番茄SlWDR204基因对干旱胁迫具有很好的抵御作用。亚细胞定位结果显示，SlWDR204与CUL4、DDB1定位相同[3]，均定位于细胞核中，说明SlWDR204可能与CUL4、DDB1发生相互作用，共同行使功能。前期的研究结果也表明，SlWDR204在CUL4泛素E3连接酶复合体中起到底物识别亚基的作用[4]，SlWDR204蛋白与CUL4形成复合体之后，具有相应的生物学活性，参与植物生长发育的调控，如修复UV损伤、果实发育和抵御病害等。也有研究表明WD40家族其他成员（如SlWD6[9]、SlWDR141[10]）在抗旱或耐盐等方面有重要功能。

目前只对番茄SlWDR204基因的抗旱性进行研究，在试验过程中亦发现转基因植株分支较多现象，但未能进行深入探究。下一步将探究转基因植株的多分支机理以及进一步研究SlWDR204基因抗旱的分子生物学机制。

参考文献

[1]阮孟斌，彭明.植物响应非生物胁迫相关基因的研究进展[J].热带生物学报，2011，2（4）：364-372.

[2]崔杰，孙西欢，马娟娟，等.干旱胁迫及复水对作物生长和产量影响的研究[J].山西水利，2011，27（6）：31-32，42.

[3]朱芸晔.番茄DWD家族的生物信息学分析及生化特征[D].合肥：合肥工业大学，2015.

[4]BIEDERMANNS，HELLMANNH.WD40andCUL4basedE3ligases：Lubricatingallaspectsoflife[J].Trendsinplantscience，2010，16（1）：38-46.

[5]ZHUYY，HUANGSX，MIAOM，etal.Genomewideidentification，sequencecharacterization，andproteinproteininteractionpropertiesofDDB1（damagedDNAbindingprotein1）bindingWD40repeatfamilymembersinSolanumlycopersicum[J].Planta，2015，241（6）：1337-1350.

[6]WANGYL，LIQ，XIEJ，etal.InvolvementofthesingleCul4geneofChinesemittencrabEriocheirsinensisinspermatogenesis[J].Gene，2014，536（1）：9-17.

[7]SCRIMAA，FISCHERES，LINGARAJUGM，etal.DetectingUVlesionsinthegenome：ThemodularCRL4ubiquitinligasedoesitbest！[J].FEBSLetters，2011，585（18）：2818-2825.

[8]熊桂紅，刘小娟，杨靓，等.水稻蛋白激酶OsCIPK5的亚细胞定位分析及RNAi转基因水稻的获得[J].福建农业学报，2017，32（4）：353-358.

[9]杨述章，高兰阳，孙晓春，等.过量表达SlWD6基因增强番茄抗旱和耐盐功能[J].应用与环境生物学报，2015，21（3）：413-420.

[10]余佳，苗敏，高兰阳，等.番茄SlWDR141基因的克隆及功能研究[J].中国科技论文，2017，12（6）：639-646.