新疆乌鲁木齐传统酸奶中乳酸菌的多样性分析

薛艳蓉，王呈，梁茂文，弓耀忠，赵瑞生，田歌，刘波

(1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，太原 030032；2.山西省食品质量安全监督检验研究院，太原 030012)

新疆地处我国边疆，因其独特的自然环境和地理环境成为我国重要的畜牧业基地。因为生活习惯和气候的差异，各少数民族制作出很多独特的食品，传统酸奶就是少数民族民族群众日常生活中不可或缺的一种食品，其生产方法简单，完全靠自然发酵，风味独特。研究发现，新疆哈萨克牧民食用酸奶可能是预防食道癌的有效方法之一，酸奶的食用与胃癌发生率呈负相关关系[1,2]。

经过千百年的自然驯化，新疆的传统酸奶中蕴藏着丰富的有优良特性的乳酸菌，其乳酸菌资源的生物多样性是其他国家所没有的[3]。在发酵乳制品生产过程中，产酸快的乳酸菌可以缩短发酵时间，提高生产效率，从而降低生产成本，提高经济效益[4]。随着近年来酸奶工业的快速发展，我国对于菌种资源的保护与开发利用越来越重视，新疆传统酸奶作为优良菌种的载体，受到越来越多的关注。

本研究运用传统生理生化鉴定方法，结合16S rDNA序列同源性分析进行菌种鉴定，从新疆乌鲁木齐地区传统酸奶中筛选具有优良特性的乳酸菌，从而丰富发酵乳制品的发酵剂种类。

1 材料与方法

1.1 材料

6份酸奶样品购买于新疆乌鲁木齐牧民家庭。

试剂：MRS琼脂培养基；改良MC培养基；M17培养基；细菌基因组DNA 提取试剂盒。

仪器：超净工作台；立式高压灭菌锅；电热恒温培养箱；厌氧操作箱；电显微镜；PCR仪；ATB微生物鉴定和药敏分析仪。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化

取1mL样品制成不同梯度的菌悬液，分别为10-3、10-4、10-53个梯度。取0.1mL菌悬液于MRS培养基、M17培养基和改良MC培养基上均匀涂布，37℃恒温厌氧培养48h。选取细菌数量适中的平板，挑取有典型菌落形态的单菌落在MRS培养基上划线纯化，挑取纯化菌落进行革兰氏染色、镜检[5]。

1.2.2 乳酸菌的生理生化鉴定

从纯化培养基上挑取单个菌落接种于NaCl水溶液中稀释，将菌液稀释到标准比浊度，将稀释好的标准液接种于试剂条，把试剂条放入ATB微生物鉴定仪中培养，24h后读结果。

1.2.3 16S rDNA基因序列分析

采用细菌基因组D N A提取试剂盒提取乳酸菌的基因组D N A，并进行P C R扩增。引物为( 5'－AACGCGAAGAACCTTAC－3')和( 5'－CGGTGTGTACAAGACCC－3')。PCR反应体系：引物各1µL，dNTP 4µL，10×PCR buffer 5µL，MgCl24µL，Taq酶0.5µL，模板DNA 2µL，用dd H2O补至50µL。PCR扩增程序：94℃预变性5min，循环（94℃变性1min，56℃退火45s，72℃延伸2min）30个，72℃延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增产物送往山西兆恩因生物公司测序。

1.2.4 同源性分析

采用MEGA5中的邻接法将测序结果与BLAST中获得的标准菌株的16S rDNA 基因序列进行系统发育树的构建。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌分离纯化结果

培养皿中多为表面光滑、边缘整齐、中央凸起的白色或半透明状菌落。经过纯化培养，共分离纯化到86株乳酸菌，经革兰氏染色都呈阳性。显微镜观察菌体形态（图1）：杆菌显微形态为长杆状或短杆状，多数呈链状排列；球菌呈圆形或卵圆形，以单个、成链或成片排列。进一步根据形态特征，挑选不同形态的30株乳酸菌进行进一步鉴定，标记为L1～L30。

图1 显微镜下的菌体形态

2.2 生理生化鉴定结果

ATB微生物鉴定仪分析结果如表1所示。表中所显示的%ID＞99、T＞0.75是非常好的鉴定，%ID＞90、T＞0.5是好的鉴定；ID值是根据待检细菌各种不同生化反应结果计算出的鉴定百分率，用其找出待检菌在整个数据库中应属于哪个分类单位。T值表示待检菌的分类单位，其被确定以后，可根据T值来评定其与该分类单位中典型菌株的相似性，从而可以确定待检菌在“种”中的典型程度[6]。

表1 微生物鉴定结果

30株菌株是根据在显微镜下菌体形态不同筛选出来的，分离菌株时从同一样品中也分出很多不同的菌株，经过生理生化鉴定后发现这些不同形态的菌属于同种菌，但它们之间的生理生化特性却有差异。L1、L8、L9、L15鉴定结果都是干酪乳杆菌，L1、L8、L9与干酪乳杆菌的特性符合，L15能利用木糖，这并不符合干酪乳杆菌的特性。

2.3 16S rDNA序列分析结果

扩增的片段经测序后，进行BLAST同源序列搜索，根据16S rRNA 基因序列比对分析得出（图2）：菌株L1、L9、L15、L8与标准菌株Lactobacillus casei处于同一分支，且相似度为100%，可将其鉴定为干酪乳杆菌；L2、L10、L13与标准菌株Lactobacillus paracasei处于同一分支，且相似度为100%，将其鉴定为副干酪乳杆菌；L3、L11、L14与标准菌株Lactobacillus plantarum相似度为99%，因此鉴定为植物乳杆菌；L4与菌株Lactobacillus rhamnosus相似度达100%，故鉴定其为鼠李糖乳杆菌；L5与标准菌株Lactobacillus reuteri处于同一分支，相似度达99%，将其鉴定为罗伊氏乳杆菌；L6、L20、L26与标准菌株Lactobacillus fermeutum相似度为100%，因此把其鉴定为发酵乳杆菌；L7与Lactobacillus gasseri标准菌株处于同一分支，相似度达100%，因此判定其为格氏乳杆菌；L12、L30与菌株Streptococcus thermophilus在同一分支，相似度为100%，因此将其鉴定为嗜热链球菌；L16、L21、L25与Enterococcus faecium相似度为100%，将其鉴定为屎肠球菌；L17、L18、L24与标准菌株Enterococcus durans处于同一分支，相似度达99%，将其鉴定为坚强肠球菌；L19、L27与菌株Enterococcus hirae相似度为99%，因此判定其为肠道肠球菌；L22、L28与Lactobacillus curvatus标准菌株处于同一分支，相似度100%，故鉴定其为弯曲乳杆菌；L23与Enterococcus lactis相似度为99%，所以鉴定其为乳酸肠球菌；L29与标准菌株Streptococcus lutetiensis处于同一分支，相似度100%，所以将其鉴定为黄连链球菌。

图2 30株乳酸菌16S rDNA基因序列的同源树

3 讨论

传统酸奶中含有丰富的乳酸菌，随着活菌自然生长，酸奶pH值会随着时间的变化而降低，乳酸杆菌对酸的耐受性通常高于乳酸球菌。当环境酸度较高时，乳酸球菌的生长受到抑制，耐酸性差的乳酸球菌难以存活，所以很难从酸奶中分离出乳酸球菌[7]。因此，将新鲜样品放置于冰块箱中冷藏，回到实验室需立即进行采样。传统酸奶为多种菌株混合发酵，为保证能准确分离传统酸奶中所有乳酸菌，本研究的样品稀释倍数较低，分别在10-3、10-4、10-5浓度下分离菌株，以保证乳酸菌菌种不因稀释倍数较大而缺失。

本试验通过传统方法结合16S rDNA序列同源性分析分离鉴定出86株、14种乳酸菌，包括了乳品以及发酵工业中常见的菌种，特别是很多有益生特性的菌种。乳杆菌属有干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌和弯曲乳杆菌，其中植物乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌与前人研究结果一致，另外本研究筛选出了鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、格氏乳杆菌和弯曲乳杆菌。罗伊氏乳杆菌常栖息于人和动物的肠道系统中，能产生一种特殊的抑菌物质——罗伊氏素，是调节肠道功能的益生菌[8]。研究表明鼠李糖乳杆菌对酸度耐受性较高，具有较好的益生特性，可作为今后开发功能性产品的潜在益生菌株[9]。弯曲乳杆菌所产生的细菌素具有很好的热稳定性和耐酸碱性，抑菌谱较广，可作为天然的防腐剂[10]。肠球菌属有屎肠球菌、坚强肠球菌、肠道肠球菌、乳酸肠球菌。链球菌属有嗜热链球菌和黄连链球菌。

新疆传统酸奶是一个复杂的微生物体系，其中的乳酸菌资源具有无可比拟的生物多样性和基因多样性[11]。赵蕊等[12]筛选了新疆伊犁巩留地区传统酸奶的优势菌，共得到71株乳酸菌，包括32株球菌和39株杆菌，分别是乳杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、乳球菌属、链球菌属。蒋艾延[13]对塔城酸奶进行了分析，结果筛选出3个属7个种，分别是植物乳杆菌、发酵乳杆菌、耐久肠球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、海氏肠球菌和乳酸片球菌，产酸快的是乳杆菌属。袁雪林[14]运用可培结合非可培的PCR-DGGE技术对喀什地区酸奶进行分析研究，得到7种乳酸菌，分别是德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、鸡乳杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌、耐久肠球菌，其中优势菌是德氏乳杆菌。由此可见，地域、环境不同，传统酸奶中蕴藏的乳酸菌种类也不完全相同。

传统发酵乳制品源于多种菌株混合自然发酵，菌株之间直接相互作用，不仅丰富了酸奶的口感和产物，有利于人体健康，还能够抵御噬箘体的污染。因此，研究开发这些菌株、制作多菌株的混合发酵剂，可促进乳品工业的快速发展。