薛艳蓉,王呈,梁茂文,弓耀忠,赵瑞生,田歌,刘波
(1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所,太原 030032;2.山西省食品质量安全监督检验研究院,太原 030012)
新疆地处我国边疆,因其独特的自然环境和地理环境成为我国重要的畜牧业基地。因为生活习惯和气候的差异,各少数民族制作出很多独特的食品,传统酸奶就是少数民族民族群众日常生活中不可或缺的一种食品,其生产方法简单,完全靠自然发酵,风味独特。研究发现,新疆哈萨克牧民食用酸奶可能是预防食道癌的有效方法之一,酸奶的食用与胃癌发生率呈负相关关系[1,2]。
经过千百年的自然驯化,新疆的传统酸奶中蕴藏着丰富的有优良特性的乳酸菌,其乳酸菌资源的生物多样性是其他国家所没有的[3]。在发酵乳制品生产过程中,产酸快的乳酸菌可以缩短发酵时间,提高生产效率,从而降低生产成本,提高经济效益[4]。随着近年来酸奶工业的快速发展,我国对于菌种资源的保护与开发利用越来越重视,新疆传统酸奶作为优良菌种的载体,受到越来越多的关注。
本研究运用传统生理生化鉴定方法,结合16S rDNA序列同源性分析进行菌种鉴定,从新疆乌鲁木齐地区传统酸奶中筛选具有优良特性的乳酸菌,从而丰富发酵乳制品的发酵剂种类。
6份酸奶样品购买于新疆乌鲁木齐牧民家庭。
试剂:MRS琼脂培养基;改良MC培养基;M17培养基;细菌基因组DNA 提取试剂盒。
仪器:超净工作台;立式高压灭菌锅;电热恒温培养箱;厌氧操作箱;电显微镜;PCR仪;ATB微生物鉴定和药敏分析仪。
1.2.1 乳酸菌的分离纯化
取1mL样品制成不同梯度的菌悬液,分别为10-3、10-4、10-53个梯度。取0.1mL菌悬液于MRS培养基、M17培养基和改良MC培养基上均匀涂布,37℃恒温厌氧培养48h。选取细菌数量适中的平板,挑取有典型菌落形态的单菌落在MRS培养基上划线纯化,挑取纯化菌落进行革兰氏染色、镜检[5]。
1.2.2 乳酸菌的生理生化鉴定
从纯化培养基上挑取单个菌落接种于NaCl水溶液中稀释,将菌液稀释到标准比浊度,将稀释好的标准液接种于试剂条,把试剂条放入ATB微生物鉴定仪中培养,24h后读结果。
1.2.3 16S rDNA基因序列分析
采用细菌基因组D N A提取试剂盒提取乳酸菌的基因组D N A,并进行P C R扩增。引物为( 5'-AACGCGAAGAACCTTAC-3')和( 5'-CGGTGTGTACAAGACCC-3')。PCR反应体系:引物各1µL,dNTP 4µL,10×PCR buffer 5µL,MgCl24µL,Taq酶0.5µL,模板DNA 2µL,用dd H2O补至50µL。PCR扩增程序:94℃预变性5min,循环(94℃变性1min,56℃退火45s,72℃延伸2min)30个,72℃延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增产物送往山西兆恩因生物公司测序。
1.2.4 同源性分析
采用MEGA5中的邻接法将测序结果与BLAST中获得的标准菌株的16S rDNA 基因序列进行系统发育树的构建。
培养皿中多为表面光滑、边缘整齐、中央凸起的白色或半透明状菌落。经过纯化培养,共分离纯化到86株乳酸菌,经革兰氏染色都呈阳性。显微镜观察菌体形态(图1):杆菌显微形态为长杆状或短杆状,多数呈链状排列;球菌呈圆形或卵圆形,以单个、成链或成片排列。进一步根据形态特征,挑选不同形态的30株乳酸菌进行进一步鉴定,标记为L1~L30。
图1 显微镜下的菌体形态
ATB微生物鉴定仪分析结果如表1所示。表中所显示的%ID>99、T>0.75是非常好的鉴定,%ID>90、T>0.5是好的鉴定;ID值是根据待检细菌各种不同生化反应结果计算出的鉴定百分率,用其找出待检菌在整个数据库中应属于哪个分类单位。T值表示待检菌的分类单位,其被确定以后,可根据T值来评定其与该分类单位中典型菌株的相似性,从而可以确定待检菌在“种”中的典型程度[6]。
表1 微生物鉴定结果
30株菌株是根据在显微镜下菌体形态不同筛选出来的,分离菌株时从同一样品中也分出很多不同的菌株,经过生理生化鉴定后发现这些不同形态的菌属于同种菌,但它们之间的生理生化特性却有差异。L1、L8、L9、L15鉴定结果都是干酪乳杆菌,L1、L8、L9与干酪乳杆菌的特性符合,L15能利用木糖,这并不符合干酪乳杆菌的特性。
扩增的片段经测序后,进行BLAST同源序列搜索,根据16S rRNA 基因序列比对分析得出(图2):菌株L1、L9、L15、L8与标准菌株Lactobacillus casei处于同一分支,且相似度为100%,可将其鉴定为干酪乳杆菌;L2、L10、L13与标准菌株Lactobacillus paracasei处于同一分支,且相似度为100%,将其鉴定为副干酪乳杆菌;L3、L11、L14与标准菌株Lactobacillus plantarum相似度为99%,因此鉴定为植物乳杆菌;L4与菌株Lactobacillus rhamnosus相似度达100%,故鉴定其为鼠李糖乳杆菌;L5与标准菌株Lactobacillus reuteri处于同一分支,相似度达99%,将其鉴定为罗伊氏乳杆菌;L6、L20、L26与标准菌株Lactobacillus fermeutum相似度为100%,因此把其鉴定为发酵乳杆菌;L7与Lactobacillus gasseri标准菌株处于同一分支,相似度达100%,因此判定其为格氏乳杆菌;L12、L30与菌株Streptococcus thermophilus在同一分支,相似度为100%,因此将其鉴定为嗜热链球菌;L16、L21、L25与Enterococcus faecium相似度为100%,将其鉴定为屎肠球菌;L17、L18、L24与标准菌株Enterococcus durans处于同一分支,相似度达99%,将其鉴定为坚强肠球菌;L19、L27与菌株Enterococcus hirae相似度为99%,因此判定其为肠道肠球菌;L22、L28与Lactobacillus curvatus标准菌株处于同一分支,相似度100%,故鉴定其为弯曲乳杆菌;L23与Enterococcus lactis相似度为99%,所以鉴定其为乳酸肠球菌;L29与标准菌株Streptococcus lutetiensis处于同一分支,相似度100%,所以将其鉴定为黄连链球菌。
图2 30株乳酸菌16S rDNA基因序列的同源树
传统酸奶中含有丰富的乳酸菌,随着活菌自然生长,酸奶pH值会随着时间的变化而降低,乳酸杆菌对酸的耐受性通常高于乳酸球菌。当环境酸度较高时,乳酸球菌的生长受到抑制,耐酸性差的乳酸球菌难以存活,所以很难从酸奶中分离出乳酸球菌[7]。因此,将新鲜样品放置于冰块箱中冷藏,回到实验室需立即进行采样。传统酸奶为多种菌株混合发酵,为保证能准确分离传统酸奶中所有乳酸菌,本研究的样品稀释倍数较低,分别在10-3、10-4、10-5浓度下分离菌株,以保证乳酸菌菌种不因稀释倍数较大而缺失。
本试验通过传统方法结合16S rDNA序列同源性分析分离鉴定出86株、14种乳酸菌,包括了乳品以及发酵工业中常见的菌种,特别是很多有益生特性的菌种。乳杆菌属有干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌和弯曲乳杆菌,其中植物乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌与前人研究结果一致,另外本研究筛选出了鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、格氏乳杆菌和弯曲乳杆菌。罗伊氏乳杆菌常栖息于人和动物的肠道系统中,能产生一种特殊的抑菌物质——罗伊氏素,是调节肠道功能的益生菌[8]。研究表明鼠李糖乳杆菌对酸度耐受性较高,具有较好的益生特性,可作为今后开发功能性产品的潜在益生菌株[9]。弯曲乳杆菌所产生的细菌素具有很好的热稳定性和耐酸碱性,抑菌谱较广,可作为天然的防腐剂[10]。肠球菌属有屎肠球菌、坚强肠球菌、肠道肠球菌、乳酸肠球菌。链球菌属有嗜热链球菌和黄连链球菌。
新疆传统酸奶是一个复杂的微生物体系,其中的乳酸菌资源具有无可比拟的生物多样性和基因多样性[11]。赵蕊等[12]筛选了新疆伊犁巩留地区传统酸奶的优势菌,共得到71株乳酸菌,包括32株球菌和39株杆菌,分别是乳杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、乳球菌属、链球菌属。蒋艾延[13]对塔城酸奶进行了分析,结果筛选出3个属7个种,分别是植物乳杆菌、发酵乳杆菌、耐久肠球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、海氏肠球菌和乳酸片球菌,产酸快的是乳杆菌属。袁雪林[14]运用可培结合非可培的PCR-DGGE技术对喀什地区酸奶进行分析研究,得到7种乳酸菌,分别是德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、鸡乳杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌、耐久肠球菌,其中优势菌是德氏乳杆菌。由此可见,地域、环境不同,传统酸奶中蕴藏的乳酸菌种类也不完全相同。
传统发酵乳制品源于多种菌株混合自然发酵,菌株之间直接相互作用,不仅丰富了酸奶的口感和产物,有利于人体健康,还能够抵御噬箘体的污染。因此,研究开发这些菌株、制作多菌株的混合发酵剂,可促进乳品工业的快速发展。