硫酸盐还原菌分离及其处理煤矿酸性废水工艺的实验研究

董艳荣，狄军贞，胡海洋，周君厚，阮 浈，孙雪莹，赵中茜

(辽宁工程技术大学 土木工程学院，辽宁 阜新 123000)

1 研究背景

煤矿酸性废水(acid mine drainage,AMD)具有高酸度、高硫酸盐的特点，其中往往还含铜、锌、镍、铅、铬、铁、汞、锰等多种毒性很强和浓度很高的重金属离子[1]。若不经修复处理直接排放，就会造成矿区周边水资源大面积的酸污染和重金属含量超标[2]。煤矿酸性废水对生态环境具有严重的危害性，已成为一个全球性的问题，受到人们普遍关注[3]。以硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)为优势菌种的微生物法处理煤矿酸性废水具有成本低、效率高、环保等特点[4-5]。SRB可以利用有机碳异化还原SO42-生成H2S，H2S与水中溶解态的金属离子反应产生不溶于水的硫化物沉淀，从而有效治理SO42-和重金属污染[6]。Wosiack等[7]研究表明厌氧条件下SRB能异化还原硫酸盐，并有效沉淀重金属离子。Miao Zhenyong等[8]分离得到S-7型硫酸盐还原菌菌株对煤矿酸性废水中Mn2+和Pb2+的去除率分别为93%和90%。SRB处理煤矿酸性废水具有处理效率高、酸度提升能力强等优点，具有广阔的应用前景。目前，矿区生态环境的综合治理已经成为一个极其重要且需迫切解决的课题。

因此，针对含Fe2+煤矿酸性废水直接排放污染水资源的问题，本试验选用辽宁省阜新海州露天矿煤矸石堆放区周边的污泥样作为筛选样品富集培养SRB，采用稀释涂布-叠皿夹层厌氧培养法分离纯化SRB，并对SRB生理生化特性进行分析，研究不同SRB接种量对煤矿酸性废水中pH的修复、Fe2+和SO42-离子的去除情况。

2 材料和方法

2.1 实验仪器

SY11/X-280A型手提式压力蒸汽灭菌锅、FA2104N型电子分析天平、100级超净工作台、THZ-92A型气浴恒温振荡器、Q/TBCR1型752紫外可见分光光度计等。

2.2 培养基及模拟废水的配制

培养基：K2HPO4，0.5 g；NH4Cl，1.0 g；CaCl2·2H2O，0.1 g；MgSO4·7H2O，2.0 g；Na2SO4，0.5 g；酵母膏，1.0 g；70%乳酸钠溶液，4 mL；Fe(NH4)2(SO4)2，1.2 g；抗坏血酸，0.5 g；蒸馏水，1 000 mL；pH=7.0，121℃灭菌30 min(固体培养基是在液体培养基的基础上加入20 g琼脂粉)。其中，Fe(NH4)2(SO4)2和抗坏血酸不能进行高温灭菌，用0.22 μm滤膜过滤除菌。除富集培养及分离纯化的培养基中加入Fe(NH4)2(SO4)2外，其它试验的培养基中均不添加Fe(NH4)2(SO4)2。

模拟废水：试验模拟水样根据辽宁省阜新市某煤矿采区矿井水的水质实测数据，设定模拟的煤矿酸性废水中含硫酸盐浓度约为1 000 mg/L，铁离子浓度约为55 mg/L，COD约为700 mg/L，pH值为5。

上述氯化钙、硫酸镁、氯化铵等试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

2.3 实验及分析方法

2.3.1 SRB的富集培养、分离纯化及菌种鉴定 将120 mL已灭菌的液体培养基和5 mL煤矸石堆放区取样的种泥样添加到250 mL锥形瓶中，再添加10 mL已灭菌的液体石蜡起液封作用，用橡胶塞密封，置于35℃、150 r/min的恒温振荡培养箱中进行振荡培养，观察培养基变化情况。取500 μL稀释度分别为1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的SRB菌悬液，采用稀释涂布-叠皿夹层法进行固体分离，将分离得到的单一SRB转移到液体培养基中进行扩大培养。针对分离得到SRB菌株进行革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色(银染法)，利用油镜观察拍片，进行菌株初步鉴定。

2.3.2 温度、pH值对SRB生长的影响 采用单因素试验法探究温度、pH值对SRB生长的影响，每个试验样品做3个重复，以培养液的光密度间接表示SRB数量，以相同条件下未接种SRB的培养基作为空白对照，振荡培养一定时间后取适量液体用分光光度计测OD600值。

(1)温度对SRB生长的影响：按6%的接种量将SRB接种到pH=7的等量培养基中，将试验样品分别置于25℃、28℃、31℃、34℃和37℃的培养箱中以105 r/min进行振荡培养，一定时间后取适量液体测OD600值。

(2)pH值对SRB生长的影响：按6%的接种量将SRB接种到pH值分别为5、6、7、8、9的等量培养基中，将试验样品置于34℃、105 r/min的培养箱中振荡培养，一定时间后取适量液体测OD600值。

2.3.3 SRB的生长曲线 按6%的接种量将SRB接种到已灭菌的培养基中，将接种好的样品置于34℃、105 r/min的培养箱中进行振荡培养，培养一定时间后取适量液体用分光光度计测OD600值，试验做3个重复。

2.3.4 SRB最佳生长条件正交试验设计 试验选定温度、pH和碳源3个因素，采用L9(33)正交表(表1)安排试验。按6%的接种量将SRB接种到培养基中，将接种好的样品放置在相应温度下、105 r/min振荡培养，培养2 d后分别取适量液体测定OD600值。

表1 正交试验因素与水平

2.3.5 SRB处理煤矿酸性废水 用SRB处理煤矿废水时向锥形瓶中添加400 mL煤矿废水，并添加100 mL培养基来补充SRB生长所需的C、N、P元素，控制SRB的接种量分别为0、5%、10%、15%、20%，最后加入10 mL石蜡液封并用橡胶塞密封，置于34℃、105 r/min进行振荡培养，培养一定时间后分别测定水样中SO42-和Fe2+的含量并计算去除率。其中，SO42-采用铬酸钡分光光度法测定、Fe2+采用邻菲啰啉分光光度法测定、pH采用玻璃电极法测定[9]。离子去除率公式为：

去除率=(c0-ct)/c0×100%

(1)

式中：c0为接种当天测得的初始离子浓度，g/L；ct为SRB接种第t天后的剩余离子浓度，g/L。

3 结果与讨论

3.1 富集培养及分离纯化SRB

图1为不同密封条件下SRB培养情况比照。由图1知，添加液体石蜡、塞橡胶塞的培养基在t=7 d时出现培养基变黑现象，且打开橡胶塞有臭鸡蛋气味。培养基变黑的原因是培养基中含有Fe(NH4)2(SO4)2，当培养基中富集培养出SRB时，SRB还原SO42-生成H2S，Fe2+与H2S反应生成FeS黑色沉淀，黑色沉淀可作为培养出SRB的标志，H2S有臭鸡蛋气味[10]。而未加石蜡、塞棉塞的培养基变化不明显。因此，后续试验以添加液体石蜡和塞橡胶塞的试验方法作为保证SRB振荡培养时隔绝氧气影响的措施。

采用稀释涂布-叠皿夹层法分离纯化SRB，结果如图2所示。由图2可以看出，固体培养8 d后稀释度为10-2的SRB固体培养基中出现黑色、单一的SRB菌落，其他稀释度的固体培养基中出现单一SRB菌落效果均不理想。选取单一SRB菌落移至液体培养基中进行扩大培养，培养10 d后可见液体培养基变黑且打开塞子时有臭鸡蛋气味，即得到分离纯化后的SRB。

针对分离得到SRB菌株进行革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色(银染法)，利用油镜观察拍片，进行了菌株初步鉴定。由图3可知，SRB菌株为革兰氏阴性，生长形态为卵圆形。该SRB菌株有芽孢和单极生鞭毛。因此，初步鉴定该菌株为脱硫叶菌属。

(1#、2#、3#为石蜡+橡胶塞，4#、5#为未添加石蜡+棉塞)

图2 SRB的分离纯化

图3 革兰氏染色照片(×1600)

3.2 温度、pH值对SRB生长的影响

3.2.1 温度对SRB生长的影响 在其他初始条件相同的条件下，考察温度对SRB生长的影响，结果如图4所示。

由图4可以看出，当培养温度为25、28、31、34和37℃时SRB均能生长，但生长繁殖速度存在不同。当培养温度为34℃时48 h内测得OD600最大值为0.824，SRB生长状态最好；当培养温度为28、31和37℃时SRB菌体的增加量没有34℃时明显且培养温度为25℃时SRB菌体数量变化不明显。这说明SRB生长的最适温度为34℃，高温或低温都会抑制SRB的生长。该结果与程健明等[11]的研究结果相一致，其研究表明，中温SRB最适生长温度在28～38℃。

图4 温度对SRB生长的影响

3.2.2 pH值对SRB生长的影响 pH值对SRB生长的影响见图5。培养基初始pH值对SRB生长的影响是通过影响H+与细胞中的酶相互作用而间接影响菌体活动[10]。由图5可知，初始pH值为7和8时SRB菌体数量增加量较大。其中，初始pH值为7的培养基培养到48 h时，OD600值为0.729，是48 h内出现的最大值且还具有继续增大的趋势，说明SRB最适生长的pH为7。该结果与谭向东等[12]的研究相一致，其研究发现，新疆油田回注水中的SRB有较广的pH值生长范围，且pH值为6.0～8.0区间是SRB的最佳pH值生长区间，在pH值小于6时，随着pH值的降低SRB的菌株数量将减少。由图5还可看出，当SRB的培养基初始pH为5时SRB菌体的数量也有增加，这说明SRB能够适应偏酸性的环境，可用于去除煤矿酸性废水中的离子。研究发现，SRB的耐酸性在pH =5～7之间[12]，当初始pH为4～7时，SRB具有活性且对硫酸盐的去除率随着pH的升高而增加[13]。

图5 pH值对SRB生长的影响

3.3 SRB的生长曲线

SRB的生长曲线见图6。由图6可知，SRB的生长曲线是典型的“S”型生长曲线。培养0～16 h处于停滞期，SRB在适应新的培养条件，SRB生长缓慢且菌种增加量小；16～40 h处于对数期，SRB菌种活性较高，SRB菌种数量增加较快，适合用于处理煤矿酸性废水。该菌种与付坤等[15]分离的SRB菌种相比，OD600达到最大值时所需的时间相对较短，从修复废水的角度分析，该菌种缩短了其适应新环境的培养周期。

图6 SRB的生长曲线

3.4 正交试验分析

L9(33)正交试验结果如表2和3所示。

表2 正交试验结果分析表

表3 正交试验方差分析

通过对L9(33)正交试验结果进行方差分析，得出各因子对SRB生长影响都不显著，本试验误差的自由度相对较小，使正交试验检验结果的灵敏度有所降低，从而在检验结果上掩盖了考察碳源、pH和温度3个因素的显著性。导致正交试验结果不显著的原因也可能是不同碳源因素下选取的碳源浓度不适宜，导致SRB菌种活性降低，掩盖了正交试验结果的显著性。从表3得出各因子对SRB生长影响的大小顺序是：碳源>pH>温度。直观地从表2中选择平均数大的水平A2B2C3为最优组合即温度为34℃、pH值为7、碳源为70%乳酸钠组合成SRB最佳生长条件。

3.5 SRB对含Fe2+煤矿酸性废水的去除效果

3.5.1 SRB对煤矿酸性废水pH的修复效果 不同SRB接种量对煤矿酸性废水pH的修复效果见图7。由图7可以看出，SRB接种第1～3 d时废水pH值迅速上升，第4～5 d时废水pH的变化趋于稳定。其中，添加5%、10%、15%和20%SRB菌液的煤矿酸性废水培养5 d后pH由5分别提高到6.54、6.78、6.85和6.88。SRB还原硫酸盐和催化氧化有机碳的同时使液体的pH值升高[16]，将煤矿酸性废水的pH由5提高到7左右，有利于加速SRB新陈代谢，促进煤矿酸性废水中SO42-和Fe2+的去除。

图7 不同SRB接种量对煤矿酸性废水pH的修复

3.5.2 SRB对煤矿酸性废水中SO42-的去除效果 不同SRB接种量对煤矿酸性废水中SO42-的去除效果见图8。由图8可以看出，随着SRB处理时间的延长，SRB对煤矿酸性废水中SO42-的去除率不断提高，说明SRB异化还原废水中SO42-的能力逐渐增强。SRB接种第1～3 d对煤矿废水中SO42-的去除效果明显提高。接种第5 d时，接种量为10%、15%和20%的样品对煤矿酸性废水中SO42-的去除率均大于74%，而接种量为5%的样品对煤矿废水中SO42-的去除率仅为38.68% 。这说明菌液接种量较少时接种量对SO42-的去除效果影响较大。本研究分离的SRB按10%接种量接种到废水中时，对SO42-的去除率为74.71%。杜刚等[17]研究表明，分离得到的5株SRB还原硫酸盐的能力有较大差异，对SO42-的去除率分别为44.69%、33.56%、52.05%、48.05%和88.83%。与上述学者分离的SRB相比，本研究分离的SRB还原硫酸盐的能力高于其分离的4株SRB，低于其分离的1株SRB，产生差异的原因可能是菌株自身还原能力以及修复体系初始pH值不同造成的。

图8 不同SRB接种量对煤矿酸性废水中SO42-的去除效果

3.5.3 SRB对煤矿酸性废水中Fe2+的去除效果 不同SRB接种量对煤矿酸性废水中Fe2+的去除效果见图9。由图9可以看出，随着去除时间的延长，SRB对煤矿酸性废水中Fe2+的去除率不断提高，SRB接种第1～3 d时对Fe2+的去除效果增加明显，第4 d后去除效果增加幅度较小，接种第5 d时废水中的Fe2+几乎全部去除。其中，接种5%、10%、15%和20%SRB对煤矿酸性废水中Fe2+的去除率分别为94.09%、99.18%、99.86%和99.89%。由SRB的生长曲线可知SRB接种后的16～40 h处于对数期，SRB菌种活性较高，故接种第1～3 d时对Fe2+的去除效果增加明显。此外，蒋永荣等[18]研究发现，初始Fe2+浓度在低浓度范围内可以促进SRB的生长。SRB对废水中Fe2+的去除效果明显，且SRB接种量对Fe2+的去除效果影响不大。SRB去除废水中铁离子的机理可能有以下3个方面：(1)SRB通过代谢作用，异化还原硫酸盐生成H2S，H2S又与Fe2+反应生成FeS沉淀；(2)SRB代谢活动可以产生碱性，提高了酸性废水的pH值，使Fe2+形成Fe(OH)2沉淀；(3)SRB代谢分泌到细胞外的胞外物和细胞膜表面带负电对铁离子的生物絮凝及静电吸附作用[19]。

已有研究数据显示，余水静等[20]应用SRB在温度30℃、HRT=8 d、COD/SO42-=1.6、进水SO42-浓度为2.3 g/L、进水pH=4.5的条件下，采用上流厌氧反应器运行24 d后，硫酸根平均除去率为75.35%，铁离子的去除率为88.87%。而本研究分离的SRB菌种在接种5 d后对SO42-的去除率与以上学者相近，Fe2+的去除率却提高到99.18%。产生SO42-去除效果差异不大，而Fe2+去除效果提高的原因，可能是在还原等量硫酸盐的条件下，本研究分离的SRB代谢产生碱度更高。

图9 不同SRB接种量对煤矿酸性废水中Fe2+的去除效果

4 结 论

(1)经富集培养、稀释涂布-叠皿夹层法分离纯化得到的SRB的最适生长温度为34℃，高温或低温都会抑制SRB的生长；最适pH为7，且SRB能够适应pH为5的偏酸性环境，可用于去除煤矿酸性废水中的离子；SRB的生长曲线是典型的“S”型生长曲线，培养16～40 h时处于对数期，SRB菌种活性较高。

(2)L9(33)正交试验确定SRB的最佳生长条件为：温度为34℃、pH值为7、碳源为70%乳酸钠，各因子对SRB生长影响的大小顺序是：碳源>pH >温度。

(3)接种5%、10%、15%和20%SRB对煤矿酸性废水中的Fe2+和SO42-均有去除效果，综合比较，在接种10%SRB时对煤矿酸性废水中离子去除效果较好且用菌量较少，接种时间为5 d时对SO42-和Fe2+的去除率分别为74.71%和99.18%。

(4)本研究分离得到SRB的OD600达到最大值时所需的时间相对较短，且能够适应偏酸性的煤矿酸性废水环境，对废水中SO42-的去除率相对较高，同时，对Fe2+的去除率可达到99.18%。这说明本研究分离的SRB菌种更适宜应用到处理含Fe2+煤矿酸性废水的工艺中，为矿区微生物修复含Fe2+煤矿酸性废水污染的技术提供了一定的科学依据。