沪浙地区不同泌乳期母乳脂肪酸组成及分布研究

何光华 李归浦 周 兵 肖海龙 储小军 叶兴乾

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州310058 2 贝因美婴童食品股份有限公司 杭州310053 3 贝因美（杭州）食品研究院有限公司 杭州311106 4 杭州市食品药品检验研究院 杭州310022）

母乳是婴儿的最佳主食，它富含多种人体必需脂肪酸、优质蛋白质、低聚糖和免疫物质等，与牛乳、羊乳等相比，不但营养均衡，而且更有利于婴儿的消化、吸收和利用，然而很大一部分婴儿由于某些特殊原因无法进行正常的母乳喂养，这时作为母乳替代品的婴儿配方乳粉就成为一种比较理想的选择。对于婴儿配方乳粉而言，母乳是黄金标准，母乳化是终极目标，故首要的工作是母乳研究。脂肪作为母乳的重要组成部分，一直以来都是母乳研究的热点之一。早在20 世纪60年代，国外就开始着手对母乳脂肪的研究，到目前为止，不仅广泛而深入地研究了不同地区、 不同泌乳期母乳的总脂肪酸组成[1-4]，而且还于近年来重点研究了母乳脂肪的脂质结构，包括甘油三酯和磷脂结构的脂肪酸组成及位置分布[5-6]，为婴儿配方乳粉的脂质母乳化研究奠定了基础。与国外相比，国内对母乳脂肪的研究起步较晚 （始于20 世纪90年代），虽然也有一些报道[7-10]，但这些研究均只注重对母乳总脂肪酸组成的分析，而很少涉及对母乳脂质结构的分析，严重影响了我国婴儿配方乳粉的脂质母乳化，特别是脂质结构母乳化的研究进程。

本文以我国沪浙地区乳母为对象，比较研究了不同泌乳期（0～1，1～3，3～6，6～12月）母乳的总脂肪酸、甘油三酯sn-2 位脂肪酸和磷脂脂肪酸组成，并着重对脂肪酸在母乳甘油三酯结构上的位置分布特点进行分析，为我国婴儿配方乳粉的脂质母乳化研究提供了重要的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

母乳：取自沪浙地区不同泌乳期乳母。

试剂：甲醇、正己烷、甲酸、氯仿等色谱纯试剂，乙醇、乙醚、石油醚、丙酮、氨水、三氟化硼/乙醚溶液等分析纯试剂，37 种脂肪酸甲酯混合标准品，美国Nu-Chek 公司；胰蛋白酶，美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 试验仪器

7890A 型气相色谱仪 （带FID 检测器和Supeclo 2560 型色谱柱），美国Agilent 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 母乳样本采集 采集对象：母乳样本采集对象为上海和浙江地区0～1，1～3，3～6，6～12月泌乳期乳母，根据纳入标准：（1）健康、足月、初产、单胎；（2）采用母乳喂养；（3）无抽烟、饮酒等不良生活习惯；（4）无贫血等严重营养性疾病及恶性消耗性疾病；（5）无糖尿病、高血压等慢性疾病；（6）近期无服用营养补充剂等；共征集乳母230 例，其中0～1月泌乳期乳母45 例，1～3月75 例，3～6月64例，6～12月46 例。

采集方法：所有母乳样本均采用自动吸乳器单侧乳房收集，收集时间为早上9：00～12：00，收集量为20 mL 以上。收集到的母乳样本立即分装到5 个5 mL 冻存管中，然后放至-80 ℃低温冰箱中以备脂肪酸检测分析。

1.3.2 母乳脂肪酸检测分析 母乳脂肪提取：采用氨水-乙醇提取法，具体步骤见GB5413.27-2010 第二法脂肪提取部分。

母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸制备：称取母乳脂肪20 mg 于10 mL 试管中，加入2 mL 1 mol/L Tris-HCL 缓冲液，0.2 mL 2.2%氯化钙水溶液，0.5 mL 1 g/L 胆酸钠水溶液，混合均匀，在40 ℃下水浴1 min，再加入胰脂肪酶20 mg，混匀后继续水浴3 min，冷却并添加6 mol/L HCL 溶液1 mL 和2 mL 乙醚，混匀，4 000 r/min 离心5 min，取1 mL 上清液45 ℃下氮气吹干，加入1 mL 正己烷溶解，得酶解产物。依次用5 mL 丙酮和正己烷活化氨基柱（500 mg/6 mL），将酶解产物上样，用丙酮∶正己烷=15 ∶85（体积比）5 mL 淋洗，丙酮：正己烷=50 ∶50（体积比）5 mL 洗脱，收集洗脱液，45 ℃下氮气吹干，得甘油三酯sn-2 位脂肪酸备用。

母乳磷脂脂肪酸制备：称取母乳脂肪100 mg，加入100 μL 氯仿/甲醇溶液溶解，点样于薄层板，并在展开缸中采用脂类展开剂：石油醚/乙醚/甲酸=85 ∶15 ∶2（体积比）展开。展开后风干，刮下磷脂层于试管中，加入5 mL 氯仿/甲醇溶液溶解，涡 旋2 min，超 声5 min 后，2 100 r/min 离 心5 min。取上清液45 ℃下氮气吹干，得磷脂脂肪酸备用。

母乳脂肪酸甲酯化：分别取制备得到的母乳总脂肪酸、 甘油三酯sn-2 位脂肪酸和磷脂脂肪酸，加入0.7 mL 1 mol/L 的氢氧化钾/甲醇溶液，混匀，置于60 ℃水浴中振荡3 min，待冷却至室温，加入1 mL 14%的三氟化硼/乙醚溶液，混匀，置于50 ℃烘箱中反应15 min，待冷却至室温，加入2 mL 饱和NaCl 溶液和1 mL 正己烷，混匀，4 000 r/min 离心5 min，取上清液进气相色谱检测。

母乳脂肪酸气相色谱检测：脂肪酸的分离检测采用气相色谱法，检测条件为色谱柱：Supeclo 2560（100 m×0.25 mm×0.20 μm），进样口温度：240℃，分流比：10 ∶1，进样量：1 μL，程序升温：初始温度60 ℃（保持2 min），以15 ℃/min 升至100 ℃，再以3 ℃/min 升至230 ℃（保持18 min），载气（N2）流速：1.0 mL/min；检测器温度：250℃；氢气流速：40 mL/min；空气流速：400 mL/min。

母乳脂肪酸定性与定量分析：脂肪酸的定性通过与脂肪酸甲酯混合标准品的气相图谱比较得出，脂肪酸的定量采用面积归一法得出。

1.4 数据统计

所有数据均用平均值±标准偏差表示，各组数据间的显著性差异采用单因素方差分析 （ANOVA）方法得出，所用统计都在SPSS16.0 软件中实现。

2 结果与分析

2.1 不同泌乳期母乳总脂肪酸和甘油三酯sn-2位脂肪酸组成

不同泌乳期母乳总脂肪酸和甘油三酯sn-2位脂肪酸组成分别见表1和2，从表中可以看出，中链饱和脂肪酸（MCSFA）、饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）在母乳总脂肪酸中的含量分别为7.45%～10.45%、34.42%～36.79%、35.91%～41.22%、23.63%～27.56%，而在母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸中的含量分别为10.13%～14.47%、64.99%～66.10%、22.80%～23.78%、10.19%～10.65%。不管是母乳总脂肪酸还是甘油三酯sn-2 位脂肪酸，C12：0、C14：0和C16：0、C18：0均是最主要的MCSFA 和SFA，C18：1n-9是含量最高的MUFA，而n-6 PUFA 和n-3 PUFA均主要由C18：2n-6（LA）、C20：4n-6（ARA） 和C18：3n-3（ALA）、C22：6n-3（DHA）组成。在母乳总脂肪酸中，n-6/n-3、LA/ALA、ARA/DHA 的比例分别为10.56～15.59、12.71～20.38、1.21～1.63，而在母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸中的比例分别为5.13～9.61、12.02～25.91、1.29～1.44。

就母乳总脂肪酸组成而言，随着泌乳期的延长，C12：0、C14：0和MCSFA含量呈逐渐升高的趋势，C18：1n-9、MUFA、ARA 和DHA 含量呈先显著降低而后趋于相对稳定的趋势，LA、ALA、PUFA、n-6 PUFA 和n-3 PUFA 含量呈先逐渐升高而后降低的趋势，n-6/n-3 和LA/ALA 比例呈先保持稳定而后显著升高的趋势，而C16：0、C18：0和SFA 含量以及ARA/DHA 比例在不同泌乳期母乳中均没有显著性差异。就母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸组成而言，随着泌乳期的延长，C12：0、C14：0、MCSFA、LA 以及n-6/n-3、LA/ALA 比例呈逐渐升高的趋势，ALA、ARA、DHA、n-3 PUFA 含量呈先显著降低而后趋于相对稳定的趋势，而C16：0、C18：0、SFA、C18：1n-9、MUFA、PUFA、n-6 PUFA 含量以及ARA/DHA 比例在不同泌乳期母乳中均没有显著性差异。

表1 不同泌乳期母乳总脂肪酸组成比较（%）Table1 Comparison of fatty acid composition in total lipids of breast milk during different lactation periods （%）

（续表1）

表2 不同泌乳期母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸组成比较（%）Table2 Comparison of fatty acid composition in triglyceride sn-2 position of breast milk during different lactation periods （%）

（续表2）

2.2 不同泌乳期母乳脂肪酸在甘油三酯结构中的位置分布

鉴于母乳中98%以上的脂肪是以甘油三酯形式存在[11-12]，因此母乳总脂肪酸组成可以近似作为甘油三酯总脂肪酸组成。本研究基于上述前提，以母乳总脂肪酸和甘油三酯sn-2 位脂肪酸组成为基础，通过公式[12]：

得出了不同泌乳期母乳各主要脂肪酸在甘油三酯结构中的位置分布，具体见图1和图2。从图1中可以看出，结合在母乳甘油三酯sn-2 位上的MCSFA 和SFA 占比分别高达44.5%～46.2%和59.7%～62.9%，而MUFA 和PUFA 占比却只有19.2%～21.4%和12.6%～14.9%。具体到几种最主要的脂肪酸单体（图2），结合在母乳甘油三酯sn-2 位 上 的C12：0、C16：0、ARA 和DHA 占 比 分 别 达 到51.1%～64.9% 、71.3%～75.6% 、51.2%～53.9% 和56.6%～57.7%，而C18：1n-9、LA 和ALA 占比却只有18.5%～20.5%、10.5%～11.6%、8.1%～15.1%。除了C12：0和ALA 以外，大部分主要脂肪酸包括MCSFA、SFA、MUFA、PUFA、C16：0、C18：1n-9、LA、ARA 和DHA 在母乳甘油三酯结构中的位置分布相对稳定，其结合在sn-2 位上的占比随泌乳期的延长几乎没有变化。

2.3 不同泌乳期母乳磷脂脂肪酸组成

不同泌乳期母乳磷脂脂肪酸组成见表3，从表中可以看出，MCSFA、SFA、MUFA 和PUFA 的含量分别为8.61%～14.61%、78.13%～82.44%、7.09%～9.14%、9.98%～13.45%，n-6/n-3 的比例为4.97～8.60。随着泌乳期的延长，C12：0、C14：0、MCSFA、LA、ALA 含量以及n-6/n-3 比例呈逐渐升高的趋势，C16：0和SFA 含量呈先稳定而后显著下降的趋势，PUFA 和n-6 PUFA 含量呈先稳定而后显著升高的趋势，n-3 PUFA、ARA 和DHA 含量呈先显著降低而后趋于相对稳定的趋势，而C18：0、C18：1n-9和MUFA 含量在不同泌乳期母乳中均没有显著性差异。

图1 不同泌乳期母乳中各类脂肪酸结合在甘油三酯sn-2 位上的占比Fig.1 The ratios of MCSFA，SFA，MUFA and PUFA esterified in triglyceride sn-2 position of breast milk during different lactation periods

图2 不同泌乳期母乳中各种主要脂肪酸结合在甘油三酯sn-2 位上的占比Fig.2 The ratios of C12：0，C16：0，C18：1n-9，LA，ALA，ARA and DHA esterified in triglyceride sn-2 position of breast milk during different lactation periods

表3 不同泌乳期母乳磷脂脂肪酸组成比较（%）Table3 Comparison of fatty acid composition in phospholipids of breast milk during different lactation periods （%）

3 讨论

截至目前，尽管国内也有一些针对不同泌乳期母乳脂肪酸组成的研究报道，但是这些报道所涉及的母乳样本泌乳期大多在6 个月之内[8-10]，难以为不同阶段（0～6月和6～12月）婴儿配方乳粉的脂质母乳化研究提供足够的数据支撑。相比之下，本研究所采集的母乳样本同时包含了0～1，1～3，3～6，6～12月，4 个不同的泌乳期，因此更有利于直接指导不同阶段婴儿配方乳粉的脂质母乳化研究。

就母乳总脂肪酸组成而言，与欧美国家相比，本研究母乳中的PUFA、LA、ALA、ARA 和DHA 含量明显较高，而MCSFA 和SFA 含量相对较低[2，13-14]；与日本、马来西亚等沿海岛国相比，本研究母乳中的ARA 和DHA 含量相对较低[6，15]。这可能与乳母的饮食习惯不同相关，欧美国家乳母的日常饮食以富含MCSFA 和SFA 的动物性食品为主，我国乳母的脂肪酸摄入主要来源于烹饪食物用的各种富含LA 和ALA 的植物油，而日本、马来西亚等沿海岛国乳母日常饮食中摄入了更多富含ARA 和DHA 的海产品。尽管不同国家母乳的总脂肪酸组成有所差异，但是大部分主要脂肪酸随泌乳期延长的变化趋势基本相似：MCSFA、C12：0和C14：0含量逐渐升高，LA、ALA 和PUFA 含量先升高后下降，ARA 和DHA 含量先显著下降而后趋于稳定，而SFA、C16：0和C18：0含量几乎没有变化。这种相似的变化趋势主要与乳母以及婴儿在不同时期的生理特点和需求相关[9-10，16]。

除了母乳总脂肪组成以外，母乳脂肪酸在甘油三酯结构上的位置分布也一直是备受科学界关注的热点之一。近年来，国外学者对此进行了重点研究，相比之下，国内在这方面的研究很少。本研究显示，沪浙地区母乳脂肪中MCSFA、SFA、C12：0、C16：0、ARA 和DHA主要结合在甘油三酯sn-2 位上，而MUFA、C18：1n-9、PUFA、LA 和ALA 主要分布在甘油三酯sn-1，3 位上，且几乎不随泌乳期的变化而变化，其结果与国外母乳基本相似[5，17-18]。母乳这种相对稳定的特殊甘油三酯结构非常有利于婴儿对脂肪酸、 矿物质以及脂溶性维生素等营养物质的消化吸收[12]。研究表明，甘油三酯进入婴儿体内后，首先必须经过体内胰脂酶的水解，水解产物分别是sn-2 位单甘酯和sn-1，3 位游离脂肪酸，其中sn-2 位单甘酯容易与胆汁酸形成乳糜微粒而直接被肠黏膜吸收，sn-1，3 位游离脂肪酸中，不饱和脂肪酸也能被机体吸收，而饱和脂肪酸特别是长链饱和脂肪酸如C16：0和C18：0，容易与钙和镁等矿物质形成不溶性的皂化物而无法被机体吸收，这不仅会造成饱和脂脂肪酸和钙、镁的流失，同时还会使婴儿产生便秘问题[19-20]。另有研究显示，与脂肪酸随机分布的甘油三酯相比，DHA 和ARA 主要结合在sn-2 位上的特殊甘油三酯更有利于机体对DHA 和ARA 的吸收利用[21]。

磷脂作为母乳脂肪中的第二大类脂质，虽然只占母乳总脂肪的1.0%～1.5%，但却是婴儿生长发育所必需的基础营养物质。脂肪酸特别是长链多不饱和脂肪酸（DHA 和ARA）在母乳磷脂中的含量与婴儿大脑和视力的快速发育直接相关。然而，截至目前，国外关于母乳磷脂脂肪酸组成的研究很少，而国内几乎是空白。本研究显示，母乳磷脂脂肪酸中的ARA 和DHA 含量分别为0.70%～1.19%、0.82%～1.41%，尽管不同泌乳期之间有所差异，但均显著高于其在母乳总脂肪酸中的含量（0.54%～0.80%、0.38%～0.62%），结果与国外母乳相似[6，14]，这种脂质脂肪酸组成模式更有利于促进婴儿大脑和视力的快速发育。已有研究表明，结合在磷脂上的DHA 和ARA 比结合在甘油三酯上的更容易被婴儿吸收和利用[21]。

4 结论

通过对我国沪浙地区不同泌乳期母乳总脂肪酸、甘油三酯sn-2 位脂肪酸和磷脂脂肪酸的组成及分布研究，得出：（1）除饱和脂肪酸（不包括中链）以外，母乳中大部分主要脂肪酸的含量均随泌乳期的变化而变化，且变化趋势与国内外其它母乳研究结果基本相似；（2）母乳脂肪酸中，大部分饱和脂肪酸（包括中链）主要结合在甘油三酯sn-2位上，而不饱和脂肪酸（ARA 和DHA 除外）主要分布在甘油三酯sn-1，3 位上，且分布比例相对稳定，几乎不随泌乳期的延长而变化；（3）不管泌乳期如何变化，母乳磷脂脂肪酸中的DHA 和ARA含量始终显著高于其在母乳总脂肪酸中的含量；（4） 鉴于母乳脂肪酸在甘油三酯和磷脂结构中的特殊分布，婴儿配方乳粉脂质母乳化研究不仅要关注对母乳总脂肪酸组成的模拟，更应该注重对母乳甘油三酯结构脂肪酸分布以及磷脂脂肪酸组成的模拟。