铁皮石斛与其他不同品种石斛HPLC特征图谱比较研究

宋红坤，蒋明明，林 涛，刘兴勇，王继良，刘宏程*

(1.昆明医科大学 药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明650500；2.云南省农业科学院 质量标准与检测技术研究所，云南 昆明650205)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)属兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw.)植物，是我国名贵中药材，始载于《神农本草经》，列为上品。铁皮石斛性味甘，微寒，归胃、肾经，具有滋阴清热、益胃生津之功效[1-2]。现代药理学研究证明，铁皮石斛可用于慢性萎缩性胃炎、高血压、糖尿病等症的治疗，具有抗肿瘤、抗衰老等作用[3]。2010版《中华人民共和国药典》(下简称《中国药典》)将铁皮石斛从石斛中分开，单列一味，足见其作用特殊。

铁皮石斛主要分布于浙江、广西、福建和云南等地。由于铁皮石斛特殊的生长环境和人们的不合理采掘，铁皮石斛的野生资源已日趋枯竭，铁皮石斛是目前人工栽培最主要的石斛品种。石斛种类繁多，致使铁皮石斛市场假冒、伪劣等现象严重。虽然 2010 版《中国药典》将铁皮石斛独立建立品系，但在市场上还未规范化。目前铁皮石斛仍主要以外观性状鉴别和以多糖含量为指标，这样的鉴别方法既难以测定铁皮石斛有效成分的含量，加工成商品后又难以辨别是否含有铁皮石斛成分，严重影响了铁皮石斛的产品质量和市场形象。

石斛真伪鉴别及质量受到重视，各种鉴别技术也在不断发展。石斛鉴别常用方法有传统显微鉴定、化学指纹图谱、DNA指纹图谱等[4]，HPLC指纹图谱适用普遍，作为化学指纹图谱是中草药领域质量评价公认方法，其作为样本自身的化学条码侧重于对品质的鉴定，反映的化学成分信息既有种内的共性，又因种类不同而具有差异性。因此，化学指纹图谱兼具了表征属性识别和质量控制技术，能为石斛真伪鉴别及质量评价提供强有力的手段。

目前，基于色谱指纹图谱的石斛鉴别研究主要是建立一种待鉴别石斛的指纹图谱，再以该指纹图谱和其他种类石斛图谱比较，该方法针对性强[5-6]。本实验应用HPLC技术，采用全轮廓指纹图谱方法进行了铁皮石斛HPLC特征图谱的研究，并对其他七个品种石斛(流苏、球花、紫皮、金钗、鼓槌、苞鞘、兜唇)进行特征图谱的比较研究，以期对铁皮石斛质量标准的建立及市场的规范化提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

Waters Alliance 2695型高效液相色谱仪(四元梯度洗脱系统，配备2998紫外检测器、Empower 3操作软件，美国Waters公司)；AB204-N型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ500-E型超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

采集铁皮石斛，编号为S1～S13，其中5批鲜品铁皮石斛(S1、S2、S3、S4、S5)、1批鲜品硬角铁皮石斛(S10)、2批鲜品铁皮石斛杂交种(S11、S12)、1批干品铁皮枫斗(S13)采自云南省德宏州石斛种质资源库，1批鲜品铁皮石斛(S6)采自云南广南，1批鲜品铁皮石斛(S7)采自浙江，1批鲜品铁皮石斛采自霍山(S8)，1批鲜品铁皮石斛(S9)采自串朋；其他7种石斛鲜品各1批采自云南省德宏州石斛种质资源库。取上述收集的鲜品石斛药材茎，将其剪碎后，在60 ℃的电热鼓风干燥箱下烘干，打粉，过60目筛，备用；干品石斛药材，打粉，过60目筛，备用。所有石斛药材经云南省农业科学研究院质量标准与检测技术研究所刘宏程研究员鉴定确认。11种对照品：对羟基苯甲酸、香草酸(批号分别为20161208、20171215，国药集团化学试剂有限公司)、丁香酸、阿魏酸(批号分别为201801291、201801161，成都艾科达化学试剂有限公司)、东莨菪内酯、石斛酚(批号分别为110768-200504、111875-201202，中国食品药品检定研究院)、滨蒿内脂、柚皮素(批号分别为R21A9F59551、518co21，北京索莱宝科技有限公司)、香豆素(批号LD20R25，北京百灵威科技有限公司)、芹菜素(批号171019，北京世纪奥科生物技术有限公司)、毛兰素为实验室自制(纯度均>98.0%)；乙腈甲醇为色谱纯(德国Merck公司)；冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)；娃哈哈矿泉水；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 铁皮石斛HPLC特征图谱的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Shiseido CAPCELL PAK MG ⅡC18(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.2%冰醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱：0～35 min为5%A→32%A，35～57 min为32%A→65%A，57～60 min为65%A→5%A；检测波长：280 nm，柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。

2.1.2 对照品溶液制备 分别取11种对照品适量，精密称定，置于10 mL容量瓶中，色谱甲醇定容至10 mL，摇匀，制成混标溶液备用。

2.1.3 供试品溶液制备 取石斛粉末2.0 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.1.4 方法学考察 (1)精密度试验。精密吸取同一批次铁皮石斛供试品溶液10 μL，连续进样6次，分别对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，结果表明各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3%，符合指纹图谱分析要求。

(2)稳定性试验。精密吸取同一批次铁皮石斛供试品溶液10 μL，分别于0、4、8、12、16、24 h进样分析，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均<3%，表明24 h内供试品溶液稳定性较好。

(3)重复性试验。取同一批铁皮石斛样品6份，分别制备供试品溶液，精密吸取铁皮石斛各供试品溶液10 μL进样分析。考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均<3%，指纹图谱的全貌无明显变化，符合指纹图谱要求。

2.1.5 样品检测 精密吸取铁皮石斛供试品溶液10 μL，按色谱条件进样分析。

2.1.6 特征图谱的建立与分析 (1)相似度分析。采用国家药典委员会《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件(2004A版)》，以平均数法生成特征图谱共有模式，计算S1～S13与共有模式的相似度分别为0.924、0.807、0.881、0.927、0.886、0.919、0.841、0.926、0.941、0.791、0.903、0.882、0.929。见图1。

图1 13批铁皮石斛HPLC特征图谱重叠

(2)色谱峰的标定。根据13批铁皮石斛供试品溶液的测定结果，共标示出55个特征共有峰，经对照品指认出11个峰，分别是16号峰对羟基苯甲酸，19号峰香草酸，21号峰丁香酸，31号峰东莨菪内脂，32号峰阿魏酸，39号峰滨蒿内酯，40号峰香豆素，48号峰柚皮素，49号峰芹菜素，52号峰石斛酚，55号峰毛兰素。见图2。

图2 13批铁皮石斛HPLC特征图谱共有模式

2.2 铁皮石斛与其他8个品种石斛HPLC特征图谱比较

2.2.1 样品检测 按照铁皮石斛HPLC特征图谱建立的色谱条件和供试品溶液制备方法，分别精密吸取8个品种石斛供试品溶液10 μL，按色谱条件进样分析。

2.2.2 相似度分析 采用国家药典委员会《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件(2004A版)》，以铁皮石斛为对照图谱，计算铁皮石斛与流苏石斛、球花石斛、紫皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、兜唇石斛、苞鞘石斛的相似度分别为0.252、0.464、0.875、0.354、0.338、0.169、0.794。见图3。

图3 8种石斛HPLC特征图谱比较

色谱峰的标定：将11种对照品混标溶液在上述色谱条件下进样，对比相对保留时间可知，1号峰为对羟基苯甲酸，2号峰为香草酸，3号峰为丁香酸，4号峰为东莨菪内脂，5号峰为阿魏酸，6号峰为滨蒿内脂，7号峰香豆素，8号峰柚皮素，9号峰芹菜素，10号峰石斛酚，11号峰毛兰素。11种成分在不同品种石斛中的检识情况。见表1。

8种石斛HPLC主要峰群比较分析：实验结果表明，不同石斛品种之间化学成分和含量有较大差异。石斛的HPLC图谱主要由4组色谱峰组成，如图3所示。第1组峰，保留时间tR<14 min，该组峰特征性不强；第2组峰，14 min

表1 11种成分在8种石斛中的检识结果

注：“-”表示在该批药材中未检出。

3 讨论

目前可加工为石斛枫斗的原植物来源广泛，市场上甚至把一些历来不作药用的石斛属及非石斛属植物也加工冒充铁皮石斛枫斗，造成了石斛市场混乱的现状。

本研究通过对13批铁皮石斛的特征图谱分析，共标定了55个特征峰，13批样品的相似度为0.791～0.929。其中样品S10的相似度为0.791，较其他批次的相似度低。本研究也将铁皮石斛和流苏石斛、球花石斛、紫皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、兜唇石斛、苞鞘石斛进行了HPLC特征图谱的比较，发现只有紫皮石斛、苞鞘石斛和铁皮石斛的相似度较高，其相似度分别为0.875、0.794，其他5个品种石斛和铁皮石斛的相似度较低，并且5个品种石斛之间的相似度也比较低。说明该指纹图谱可以作为铁皮石斛鉴别的参考依据，在此研究基础上可以将铁皮石斛、紫皮石斛、苞鞘石斛作进一步的药效学研究，为寻找铁皮石斛的替代品提供参考依据。此外，8个品种石斛主要色谱峰的数目、峰形等都存在较大差异，说明8个品种石斛所含化学成分存在较大差异，可以为寻找新石斛类药材来源提供一定的实验数据。由于药材化学成分受生长年限、生长环境、采收时间等影响较大，本次试验所收集的样品有限，故不能完全代表药材中所含成分含量，还需收集多批次样品进行深入的研究。

本研究所建立的HPLC全轮廓指纹图谱信息丰富，但对强挥发性而未有很好紫外吸收的物质，是DAD检测器的一个盲区，需串联MS等检测器进行补充和完善。样品共有峰和相似度对评价中药材质量的共性有重要价值，但不同品种指纹图谱相互间的差异也有重要意义，可采用统计软件进行聚类分析、多重方差分析及主成分分析等，为石斛的系统研究提供可靠依据[7]。