多杀性巴氏杆菌OmpH对宿主Fn和Plg粘附作用的初步研究

陈 露，朱伟峰，魏后军，胡 波，仇汝龙，范志宇，陈萌萌，薛家宾，索朗斯珠，王 芳

(1. 西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝860000 ； 2. 江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京210014 ； 3. 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏南京210014 ； 4. 国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014)

多杀性巴氏杆菌是引起多种畜禽和野生动物巴氏杆菌病的主要病原菌[1-2]。多杀性巴氏杆菌还参与其他细菌、病毒引发呼吸道病后的继发感染，进而造成更为复杂的动物呼吸道疾病[3-4]。多杀性巴氏杆菌也是一种人兽共患病病原体。与动物密切接触的人群的血清中巴氏杆菌抗体阳性率比未接触者高2倍左右[5]。人类发病主要通过伤口感染。患者创口处肿胀、剧痛、发热、形成脓肿和周围淋巴结炎，个别病例出现败血症和脑膜炎[1-2]。近年来多杀性巴氏杆菌在多种动物中的临床分离率或检出率均位居细菌性病原的前列[6-8]。

目前已经发现了多杀性巴氏杆菌部分毒力因子及可能的致病机制，如荚膜、脂多糖、外膜蛋白等[3]。但是目前尚不能完全清楚地解释巴氏杆菌病发病的分子过程，也无法完全确定各毒力因子在致病中的地位[9-10]。孔蛋白OmpH是多杀性巴氏杆菌的一种主要的外膜蛋白[11]。以往研究表明，OmpH是保护性抗原并具有粘附宿主细胞的能力，是一种粘附因子[12-13]。很多病原菌的粘附因子除了可以粘附宿主细胞外还可以粘附胞外基质成分(如纤维连接蛋白，Fibronectin，Fn)或者通过结合宿主血浆纤维蛋白溶解酶原(Plasminogen，Plg)促进细菌对宿主细胞和组织的粘附[14-15]。因而OmpH有可能通过结合宿主Fn和Plg促进多杀性巴氏杆菌对宿主的粘附。本文旨在通过研究OmpH对Fn和Plg的粘附作用，初步揭示多杀性巴氏杆菌OmpH分子致病机制。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种及培养 pET28a(+)表达载体、BL21 (DE3)宿主菌、多杀性巴氏杆菌C51-17株为本试验室保存。多杀性巴氏杆菌使用马丁肉汤(海博公司)添加10% 新生牛血清(Gbico公司)培养。大肠杆菌使用(LB)(海博公司)液体或固体培养基培养。

1.2 OmpH基因的克隆 以多杀性巴氏杆菌 PMTB2.1菌株全基因组序列[16]为参考序列，设计引物OmpH-F：5′-cagcaaatgggtcgcggatccGCAACAGTTT-ACAATCAAGACGGT-3′(小写字母为与载体相同的同源臂，下同)，OmpH-R：5′-gcaagcttgtcgacggagctc-GAAGTGTACGCGTAAACCAACACC-3′。按照文献[17]提取C51-17菌株基因组并进行PCR扩增。酶切质粒并通过同源重组克隆试剂盒(诺唯赞)将OmpH的PCR扩增片段整合到pET28a(+)载体上，然后将阳性重组质粒转入BL21。挑取阳性克隆PCR鉴定正确后送北京擎科新业有限公司南京分部测序，鉴定所克隆基因是否完整及是否正确连接到载体上。

1.3 诱导表达并鉴定 对OmpH重组大肠杆菌进行IPTG诱导表达并优化诱导条件，包括比较37 ℃、28 ℃、16 ℃的表达效果，比较0.2 mM、0.4 mM、0.6 mM、0.8 mM、1 mM等终浓度下IPTG的诱导效果。重组菌诱导表达后用超声波破碎仪器进行破碎，并离心分别收集上清和沉淀。最后进行SDS-PAGE跑胶，并进行考马斯亮蓝染色，检测表达效果。

1.4 OmpH与多杀性巴氏杆菌感染康复血清的反应 首先进行rOmpH的SDS-PAGE，然后将蛋白转入NC膜上。经过5%的脱脂乳封闭以后，37 ℃与本实验室保存的C51-17株的兔感染康复血清[18](1/500)孵育1 h；PBST漂洗5遍以后加入HRP偶联的羊抗兔IgG作为二抗，37 ℃孵育1 h；最后，漂洗后的膜用ECL显色试剂盒(诺唯赞公司)在化学发光成像系统(天能公司)中显色。

1.5 Fn和Plg结合活性检测 参照文献[14]进行Far Western Blot试验。首先进行重组OmpH的SDS-PAGE，同时以已知的能与Fn和Plg结合的红斑丹毒丝菌SpaA重组蛋白[14]作为对照。然后将蛋白转到NC膜上。经过5%脱脂乳封闭以后，加入10 μg/mL人源Fn或 Plg(Sigma公司)，37 ℃孵育2 h。漂洗5遍后，分别加入1 000倍稀释的兔抗人纤维连接蛋白抗体和兔抗人血浆纤维蛋白溶解酶原抗体，37 ℃孵育1 h。漂洗后加入HRP偶联的羊抗兔IgG作为二抗，37 ℃孵育1 h；最后，漂洗后的膜用ECL显色试剂盒(诺唯赞公司)在化学发光成像系统中显色(天能公司)。

1.6 OmpH多克隆血清的制备 所有实验动物的饲养和使用均在江苏省实验动物监督委员会的指导下进行。所有的操作规程已经获得江苏省农业科学院实验动物监督委员会的批准。将100 μg/50 μL纯化的重组蛋白用等体积弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化后，腹腔注射免疫5只小鼠，每只100 μL，14 d后，以100 μg/ 50 μL纯化的重组蛋白用等体积弗氏不完全佐剂(Sigma公司)乳化后，第2次皮下注射免疫小鼠。第2次免疫10 d后采血制备多克隆抗血清，并用蛋白A抗体纯化试剂盒(金斯瑞公司)纯化出血清中的IgG。

1.7 Plg和Fn的招募抑制试验 参照文献[19-20]进行试验。首先用多杀性巴氏杆菌C51-17株的菌体(108CFU/孔)或者重组OmpH(1 μg/孔)包被ELISA板，4 ℃过夜；经过PBST洗涤3次，以5%脱脂乳37 ℃ 封闭1 h。以50 μL 10倍稀释的抗OmpH IgG 37 ℃孵育0.5 h(孵育10倍稀释的免疫前血清IgG为对照)。PBST洗涤3遍，分别与50 μL的纤维连接蛋白(100 ng)和血浆纤维蛋白溶解酶原(100 ng)，37 ℃ 孵育1 h。洗涤后，每孔加入1 000倍稀释的兔源抗血浆纤维蛋白溶解酶原 IgG或者1 000 倍稀释的兔源抗纤维连接蛋白 IgG，37 ℃孵育0.5 h；洗涤3次，加入5 000倍稀释的HRP偶联的羊抗兔二抗，37 ℃孵育0.5 h。洗涤后，每孔加入100 μL显色液(1 mg/mL TMB和0.03%H2O2)，室温避光反应10 min后，加入终止液(2M H2SO4)。在酶标仪读取450 nm的吸光度。以抗OmpH.IgG处理组的OD值除以免疫前血清IgG处理组的OD值计算多杀性巴氏杆菌、OmpH分别对Fn和Plg的相对结合活性。试验重复3次，用t检验检测试验组和对照组的统计学差异。

2 结果

2.1 OmpH重组蛋白的表达和纯化 将扩增的OmpH基因连接到pET28a(+)载体上，阳性菌株测序结果显示，C51-17株的OmpH基因序列与PMTB2.1的OmpH基因序列完全相同并正确连接到载体上。将重组质粒转入BL21工程菌后，通过优化诱导条件，选用37 ℃、0.6 mM IPTG诱导表达，获得较多的重组蛋白rOmpH(43 kDa)，主要以包涵体形式表达(图1A)。

2.2 OmpH与多杀性巴氏杆菌康复血清的反应 Western Blot结果显示，孵育多杀性巴氏杆菌感染OmpH能够与多杀性巴氏杆菌康复血清发生特异性反应，OmpH泳道存在1条约43 kDa大小的条带，与rOmpH大小一致(图1B)。

2.3 OmpH与Fn和Plg的结合活性 针对Fn和Plg结合作用检测的Far Western Blot结果显示，rOmpH泳道上均存在1条约43 kDa的条带，与rOmpH大小一致(图2)，即OmpH具有结合Fn和Plg的能力。

图1 重组OmpH蛋白的表达及与康复血清的反应

A：重组OmpH的表达与纯化 ； M：分子大小标识 ； 1：无载体的BL21菌体粗蛋白 ； 2：未诱导的OmpH重组菌粗蛋白 ； 3：37 ℃诱导过夜的OmpH重组菌粗蛋白 ； 4：重组OmpH包涵体蛋白 ； B：Western Blot检测OmpH与康复血清的反应

图2 Far Western Blot检测OmpH对宿主Fn和Plg分子的结合作用

A：OmpH对Fn的结合作用 ； B：OmpH对Plg的结合作用；M：分子大小标识；SpaA：已知的Fn和Plg结合蛋白—红斑丹毒丝菌SpaA蛋白作为阳性对照

2.4 OmpH多克隆抗体的Fn和Plg结合抑制作用 ELISA结果如图3所示，抗OmpH.IgG能够显著降低OmpH及多杀性巴氏杆菌对于Fn和Plg的结合能力。与对照组相比，经过抗OmpH.IgG孵育后OmpH对Fn和Plg的结合作用分别下降了约20%和50%，而经过抗OmpH.IgG孵育后多杀性巴氏杆菌菌体对Fn和Plg的结合作用下降了30%左右，均差异显著(P<0.05)。

3 讨论

据报道，病原菌的免疫原性较好的分子在其致病过程中发挥作用[21-22]。本研究表达了重组多杀性巴氏杆菌OmpH，Western Blot表明OmpH与多杀性巴氏杆菌高免血清存在明显的反应。该结果提示，OmpH可能在多杀性巴氏杆菌感染与免疫反应中发挥重要作用。

Fn是细胞外基质的重要组成成分。很多病原菌通过结合该分子实现对宿主细胞的粘附进而发挥致病作用[23]。结合Fn同样也是多杀性巴氏杆菌粘附宿主细胞的重要途径[24]。但是Fn促进多杀性巴氏杆菌粘附的分子机制还不完全清楚。本研究发现OmpH能够结合Fn，而且OmpH多克隆抗体能够显著抑制多杀性巴氏杆菌对Fn的结合。因此，多杀性巴氏杆菌可能通过OmpH结合细胞外基质进而粘附宿主细胞。

图3 OmpH多克隆抗体对OmpH及多杀性巴氏杆菌结合宿主Fn和Plg的抑制作用

相对结合活性=抗OmpH抗体孵育组OD值/免疫前血清抗体孵育组OD值；*：P<0.05

Plg是动物体内重要的粘附分子，有多个可以与其他分子发生结合的结构域。很多病原菌通过结合Plg促进对宿主细胞的粘附作用[21, 25-26]。本实验室已经报道多杀性巴氏杆菌能够利用Plg[27]。本研究显示，OmpH能够结合Plg且OmpH多克隆抗体显著抑制多杀性巴氏杆菌结合Plg。OmpH很可能在多杀性巴氏杆菌结合宿主Plg过程中发挥作用，最终促进多杀性巴氏杆菌的粘附作用。

综上所述，多杀性巴氏杆菌OmpH能够结合Fn和Plg，进而促进多杀性巴氏杆菌对宿主细胞的粘附作用。本研究增加了OmpH致病作用的认识，加深了对多杀性巴氏杆菌致病机制的理解。