10株广西野鸟源新城疫病毒HN基因的遗传进化分析

谢丽基，谢芝勋，罗思思，邓显文，谢志勤，王 盛，黄娇玲 ，曾婷婷，张艳芳，范 晴，张民秀

(广西壮族自治区兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁530001)

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的以感染禽类为主的一种急性、烈性传染病。NDV 基因组包含 6 个基因，分别编码 3′NP-P-M-F-HN-L5′六种结构蛋白。HN糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，在病毒侵染过程中识别细胞受体，介导病毒吸附细胞膜，是极其重要的保护性抗原[1]，对 NDV的毒力有很大的影响。抗体免疫选择压可显著影响HN基因变异，且其受影响程度高于F基因[2]。

野鸟作为新城疫病毒的自然储存宿主，可能成为病毒的传播媒介，随自然迁徙可将病毒传染给家禽，导致疾病暴发[3]。新疆、吉林、湖南和陕西等地均报道了对鸟类新城疫进行了监测，探索了野生鸟类与家禽新城疫感染的区别和联系，通过分析新城疫病毒的遗传进化情况，可预测新城疫病毒感染家禽的流行趋势，可为新城疫的防治提供理论依据[3-4]。

本试验对2016-2017年度从广西野鸟分离到的10株NDV的HN基因，采用RT-PCR方法进行扩增和测序，并对其核苷酸序列进行遗传进化分析，为科学防控新城疫提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 毒株 10株广西野鸟源NDV分离株由本实验室分离鉴定和保存，其中鹧鸪源2株，斑鸠源5株，鸽子源3株。

1.2 主要试剂 病毒基因组RNA/DNA快速纯化试剂盒和DNA片段胶回收试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit、Premix Ex TaqTM试剂盒和pMD18-T试剂盒,购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3HN基因PCR扩增的引物 NDVHN基因扩增上游引物HN2265-F:5′-CCTMGATCAGATGAGAGC-3′，下游扩增引物HN2265-R:5′-TGTGACTCTGGTAGGAT-3′[5]，扩增的片段大小为2 265 bp。引物由深圳华大基因科技服务有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取、RT-PCR 取200 μL NDV分离株的病毒尿囊液，按照北京全式金生物技术有限公司的病毒基因组RNA/DNA快速纯化试剂盒使用说明书，提取病毒 RNA，然后按照宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit使用说明书进行反转录。使用引物HN2265-F和HN2265-R进行PCR扩增。

1.5 PCR 产物胶回收、克隆测序 将50 μL PCR产物电泳后，切胶经DNA片段胶回收试剂盒纯化回收。将纯化PCR产物克隆至pMD-18T载体。阳性克隆送深圳华大基因科技服务有限公司进行测序。

1.6HN基因进化树与同源性比较 应用Lasergen和MEGA 6软件，对测序获得的 10株NDV分离株HN基因序列，与GenBank数据库中的NDV代表株进行序列对比分析，采用邻位相连法(Neighbor-joining)和 Bootstrap值为1 000构建NDV分离株HN基因的系统进化树。

2 结果

2.1 广西野鸟源NDV分离株HN基因的PCR扩增和序列测定 运用RT-PCR对10 株野鸟源NDV分离株进行HN基因的扩增，均扩增出约2 265 bp的电泳条带(图1)。序列测定结果表明，10 株野鸟源NDV分离株HN基因的ORF全长均为1 716 bp，编码571个氨基酸。

图1 NDV 广西分离株HN基因扩增结果

M: 100 bp DNA ladder ; 1: 鹧鸪源新城疫 ； 2: 鹧鸪源新城疫；3: 鸽子源新城疫 ； 4: 鸽子源新城疫； 5: 鸽子源新城疫 ； 6: 斑鸠源新城疫； 7: 斑鸠源新城疫 ； 8: 斑鸠源新城疫 ； 9: 斑鸠源新城疫 ； 10: 斑鸠源新城疫

2.2 广西野鸟源NDV分离株HN基因序列的遗传进化分析 应用Lasergen软件，将测序获得的 10株NDV分离株HN基因的阅读框架序列，与GenBank数据库中的NDV代表株序列进行比对，结果显示，10株NDV广西野鸟源分离株HN基因之间的核苷酸同源性为83.9%～99.9%(其中159 Francolinus pintadeanus19与173 Turtledove7同源性最低，为83.7%)，所推导的氨基酸序列同源性为87.4%～99.7%(其中159 Francolinus pintadeanus19与173 Turtledove7 的同源性最低，为87.4%)。与国内外 NDV class Ⅱ参考毒株的核苷酸同源性为80.2%～98.1%， 其中2株从鹧鸪分离的NDV病毒，与 NDV基因XII型的同源性较高，为98.0%～98.1%；而斑鸠源的5株NDV病毒，以及从鸽子源的3株NDV病毒，与NDV基因VI型的同源性较高，为90.0%～91.9%。构建的系统遗传进化树见图2。所分离的10个NDV毒株，8株为Ⅱ类新城疫病毒基因VI型(斑鸠源5株，鸽子源3株)，鹧鸪分离的2株新城疫病毒，均为Ⅱ类新城疫病毒基因XII型。10株广西野鸟NDV分离株与我国经典强毒株F48E9、弱毒疫苗株LaSota和基因VII型NDV(我国目前应用最广的疫苗株基因型之一)遗传距离较远(见图2) 。

3 讨论

NDV的HN基因开放阅读框(ORF)有4种长度：第1种，ORF全长为1 851 bp，编码 616个氨基酸，该蛋白只存在于无致病性的 NDV 弱毒株中；第2种，ORF全长为1 734 bp，编码 577个氨基酸，存在于无致病性和致病性的 NDV 毒株中；第3种ORF 全长为1 716 bp，编码 571 个氨基酸，仅存在于致病性的 NDV 强毒株中；第4种ORF全长为1 716 bp，编码 571 个氨基酸，未确定存在于何种致病性的 NDV 毒株中[6]。本试验测定的10 株广西野鸟源 NDV分离毒株的HN基因ORF 均为 1 716 bp，编码 571个氨基酸，符合 NDV 强毒株的基因长度特征，与用 NDVF基因裂解位点来判断其为强弱毒株的结果一致[7]。

图2 10株广西野鸟源NDV分离株与国内外NDV参考株HN基因的遗传进化树

据报道，我国新疆、吉林、湖南和陕西等地野鸟分离的新城疫病毒，主要为Ⅱ类新城疫病毒基因I型、基因II型 和基因VI型[4]。与国内其他学者的报道类似，本试验在广西野鸟中也发现了Ⅱ类新城疫病毒基因VI型。近年来，在我国家禽首次监测到了Ⅱ类新城疫病毒基因XII型[8]，除了本团队在2018年最新的研究报告[7]，未见在野鸟发现Ⅱ类新城疫病毒基因XII型的研究报道。本试验发现我国鸟类感染了Ⅱ类新城疫病毒基因XII型，提示应警惕这种新型新城疫病毒在国内野鸟和家禽的分布和流行，加大主动监测力度，分析其流行和扩散趋势。由于当前所使用的新城疫疫苗主要为基因VII型、基因II型和基因I型，鉴于我国基因XII型新城疫的新发现，有必要开展当前疫苗对XII型新基因型新城疫的免疫效果评估。

本试验分离的10株新城疫病毒，分离时野鸟状态均良好，无发病迹象，推测野鸟对基因VI型和XII型新城疫具有较好的适应能力与抵抗性，存在对周边环境排毒的危险，广西地区鸟类资源丰富，为新城疫病毒的传播创造了便利条件。