L-脯氨酸修饰金纳米通道的制备及应用

甘惠玉， 黄 露

(闽江学院海洋学院， 福建 福州 350108)

手性是自然界的基本特征之一。手性对映体进入生态环境后，其生命活动的过程(代谢转化、排泄)往往会存在对映体选择性，而且手性物质的生物效应(致畸、致癌、致突变)也会呈现对映体选择性。在当前主要的手性拆分方法，如膜拆分法、色谱拆分法、酶拆分法、化学拆分法和结晶拆分法中，膜拆分法能量消耗低、设备装置简单、操作可持续并适用于大规模的工业化生产，因此近年来获得了广泛关注。

近年来，仿生纳米通道，由于其制备材料多样、结构稳定性高、易于进行化学或生物修饰，引起了研究人员的普遍兴趣。仿生纳米通道的应用主要集中在以下几个方面：响应型纳米流体器件[1]、生物传感[2]、能量转化[3]以及过滤[4]等。相对于这些领域，仿生纳米通道作为手性传感器在手性分离分析方面的研究还比较少。其中，Bayley课题组制备了基于α-溶血素酶蛋白的生物纳米通道，利用单分子检测技术对布洛芬和萨利多安对映体进行手性识别[5]，之后他们又在这种生物纳米通道上，利用铜离子络合物与氨基酸对映体相结合实现了对氨基酸对映体的手性识别[6]。李海兵课题组将β-环糊精修饰的PET仿生单纳米通道用于组氨酸对映体的选择性识别[7]，随后他们又将牛血清蛋白直接用于未经修饰的PET仿生单纳米通道，实现了对精氨酸对映体的手性识别[8]。黄杉生课题组在纳米通道手性拆分方面做了许多工作：将β-环糊精修饰的二氧化硅纳米通道用于苯丙氨酸对映体的手性拆分[9]；将L-半胱氨酸修饰的金纳米通道用于青霉胺对映体的手性拆分[10]；以聚碳酸酯膜为基底，自聚合多巴胺后得到聚多巴胺纳米通道膜，将壳聚糖与其共价连接后用于苯丙氨酸对映体的手性拆分[11]；利用壳聚糖修饰的金纳米通道对组氨酸对映体进行拆分，并结合表面增强拉曼光谱对D-组氨酸和L-组氨酸进行同时检测[12]。

本研究以聚碳酸酯膜为基膜，由化学沉积法制备金纳米通道膜，以色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸为研究对象，考察L-脯氨酸修饰后金纳米通道的手性拆分性能。鉴于L-脯氨酸的氨基在水溶液中带正电，会与带负电的金纳米通道表面产生静电吸引从而修饰在纳米金表面，且其不具有紫外吸收，不会干扰研究对象的检测，所以将L-脯氨酸用于金纳米通道膜的修饰。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

UV2450紫外可见分光光度计(岛津仪器苏州有限公司)；BSZ10S分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；THZ-82水浴恒温振荡器(金坛市易晨仪器制造有限公司)；PHS-3C台式pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)；PFC磁力搅拌器(上海山岳科学仪器有限公司)；GZY-P20-W超纯水机(湖南科尔顿水务有限公司)。

多孔聚碳酸脂膜(PC膜，100 nm，Whatman公司)；L-色氨酸、D-色氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和L-脯氨酸(纯度99%，上海源叶生物科技有限公司)；亚硫酸金钠(常州化工研究所有限公司)；其他试剂均为分析纯，用水为超纯水。

1.2 L-脯氨酸修饰金纳米通道的制备

采用化学沉积法制备金纳米通道。首先将PC膜放入无水甲醇中浸泡30 min；用水洗涤后，放入含有0.026 mol氯化亚锡和0.007 mol三氟乙酸的甲醇/水(50∶50，V/V)溶液中，置于水浴恒温振荡器中震荡45 min(25 ℃)；放入甲醇中漂洗3次，随后放入新制取的0.029 mol银氨溶液中10 min，然后用甲醇、水各清洗3遍；将PC膜放入镀金液中(含有0.001 25 mol碳酸氢钠、0.05 mol甲醛、0.063 6 mol 亚硫酸钠和7.9×10-4mol亚硫酸金钠，pH=10)，4 ℃恒温8 h；沉积好的PC膜用25%硝酸浸泡12 h，空气中晾干备用。将制备好的金纳米通道膜浸入1 mmol L-脯氨酸中，室温放置24 h，水洗3遍后晾干备用。

1.3 氨基酸对映体的渗析实验

将制备的复合膜固定在自制的膜渗析装置中，该装置以浓度差为驱动力。膜左侧为50 mL 含有0.2 mmol单个氨基酸对映体的50 mmol磷酸二氢钠溶液，右侧仅为50 mmol磷酸二氢钠溶液。渗析实验在室温下进行，每隔1 h从右侧溶液中取出一定量的样品并用紫外分光光度计进行检测。将被分离物质的浓度随过膜时间的变化定义为对映体的分离度α：

α=KD/KL， (1)

其中KD为D型氨基酸的过膜速率，KL为L型氨基酸的过膜速率。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

图1 3种氨基酸对映体在L-脯氨酸修饰的金纳米通道膜中的渗透情况 Fig.1 Permeation of three pairs of amino acid enantiomers in the L-proline modified gold nanochannel membrane

2.1.1 镀金时间对分离度的影响

镀金时间会影响纳米通道孔径的大小，从而影响膜通量及膜的渗透性。以酪氨酸为例，考察镀金时间(6、7、8、9、10 h)对酪氨酸对映体分离度的影响。实验结果表明：镀金时间短，孔径大，过膜速度快，氨基酸对映体与纳米通道修饰物来不及作用，导致对映体分离度小；镀金时间长，孔径小，过膜速率慢，两者的差异不明显。与其他镀金时间相比较，8 h的镀金时间分离度最佳，即镀金时间的最佳选择为8 h。

2.1.2 pH对分离度的影响

以酪氨酸为例，考察磷酸盐缓冲液pH值(4.68、5.18、5.68、6.18、6.68)对酪氨酸对映体分离度的影响。实验结果表明：当pH值小于酪氨酸的等电点(pI=5.68)时，酪氨酸的分离度随着pH的增大而增大，在酪氨酸的等电点时分离度达到最大，当pH继续增大时，分离度却随pH的增大而减小。这可能是因为在等电点下，酪氨酸分子间的静电斥力最小，分子间的相互作用增强，对映体之间的差别得以放大。因此，最后选用氨基酸的等电点作为缓冲溶液的pH值。

2.1.3 离子强度对分离度的影响

以酪氨酸为例，考察磷酸盐缓冲液浓度(10、25、50、75、100 mmol)对酪氨酸对映体分离度的影响。实验发现，当其浓度从10增大到50 mmol时，酪氨酸对映体的分离度也随之增加；当浓度从50增大到100 mmol时，酪氨酸对映体的分离度却随之减少。最终选取磷酸盐缓冲液的浓度为50 mmol。

2.2 氨基酸对映体的渗析实验

以酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸3种氨基酸对映体为测试对象，根据1.3部分开展实验，各氨基酸对映体在L-脯氨酸修饰的金纳米通道膜中的渗透情况如图1所示。图1中趋势线的斜率即为物质的过膜速率，从图1中可以看出，D型氨基酸的过膜速率均大于L型氨基酸。根据公式(1)进行计算，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸的分离度分别为1.99、1.06和1.54。为了进行比较，实验还考察了3对氨基酸对映体在原始PC膜以及未修饰的金纳米通道膜中的渗透情况(图2)。原始PC膜及未修饰的金纳米通道膜对3对氨基酸对映体几乎没有手性选择性，而L-脯氨酸修饰的金纳米通道膜对酪氨酸和苯丙氨酸具有较好的手性选择性。

图2 氨基酸对映体在不同分离膜中的分离度 Fig.2 Resolutions of amino acid enantiomers in differentseparating membranes

2.3 手性膜的重复利用性

进一步对手性膜的重复利用情况进行考察。将不做任何处理的手性膜用于酪氨酸对映体的渗透实验，连续使用5次的分离度分别为2.04、1.75、1.58、1.41、1.35。由此可见，未作任何处理的手性膜的重复性能较差。为了改善膜的重复利用性，每次使用后，将膜用水浸泡0.5 h后，再将膜放入1 mmol的L-脯氨酸溶液中浸泡1 h。将经过处理的手性膜用于酪氨酸对映体的渗透实验，连续使用5次的分离度分别为1.95、1.85、1.82、1.80、1.77。由此可见，处理后的手性膜重复使用后得到的对映体分离度变化不大，说明所制备的手性膜经过一定处理后可以重复利用。

2.4 手性选择机理

由于金纳米通道表面带负电，而L-脯氨酸具有带正电的仲胺，因此通过静电吸附作用，L-脯氨酸可以修饰到纳米金表面。在3对氨基酸对映体中，色氨酸由于其分子结构最大，对映体与L-脯氨酸的相互作用差别最小，手性膜对其几乎不具有手性选择性。而与苯丙氨酸相比，酪氨酸在苯环上多了一个羟基(图3)，这使得其与修饰在金纳米通道上的L-脯氨酸能够形成3点相互作用，增强了手性膜对其手性选择性。而对于酪氨酸对映体，由于D-酪氨酸和L-酪氨酸的氨基的空间位置不同，因而它们与L-脯氨酸的空间作用力不同，从而导致它们在通过手性膜时的过膜速率不同。

图3 酪氨酸对映体与手性膜之间的相互作用

Fig.3 Interactions between the tyrosine enantiomer and chiral membrane

3 结论

本文通过静电吸附将L-脯氨酸修饰在金纳米通道膜上制备手性膜，对可能产生影响的各种条件进行了考察，例如金沉积时间、pH值、磷酸二氢钠浓度、膜的重复利用等。在优化条件下，考察了酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸对映体在手性膜中的渗透情况。实验结果表明，L-脯氨酸修饰的金纳米通道膜对酪氨酸对映体手性选择性最好，苯丙氨酸次之，而对色氨酸对映体几乎没有手性选择性。本文结论为其他手性氨基酸修饰金纳米通道膜的制备和应用提供了参考。