益生菌发酵苹果浆工艺优化及发酵前后挥发性风味成分分析

任婷婷，岳田利，魏 欣，王 璇，袁亚宏*

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

益生菌是一类能在人类及动物肠道内定植和生长，具有抑制致病菌生长能力的有益微生物，具有抑菌、抗癌、提高机体免疫力和预防腹泻等保健功能[1-3]。大量研究表明，乳酸菌发酵是用于维持和提高果蔬营养、风味、品质、安全和货架期的最经济、最有效、最简单的生物技术方法之一[4-6]。乳酸菌发酵过程中，乳酸菌利用糖类发酵产酸和芳香化合物[7]，发酵后果汁将发酵风味与原果蔬汁的风味相结合，形成乳酸菌发酵果蔬汁独特的发酵风味[8]。苹果是我国主要水果产品之一，但多以鲜食为主，加工产量低，且主要为浓缩苹果汁，加工种类单一，附加值低[9]。苹果中富含糖类、有机酸、多酚、氨基酸、维生素等营养成分[10]，此外，还含有生物活性物质（如多酚、果胶）[7]，是对人体健康有益的天然抗氧化剂，这使得它成为益生菌发酵的理想基质[11]。

目前，乳酸菌发酵果蔬的基质主要是果蔬清汁，乳酸菌发酵苹果果浆及其风味物质的研究鲜见报道。苹果浆中含有淀粉、果胶等大分子物质，乳酸菌不能充分利用，因此需用淀粉酶和果胶酶将果浆中淀粉、果胶等酶解为利于乳酸菌发酵的小分子物质。以苹果浆为基质经乳酸菌发酵得到的果汁，对比不含果渣的苹果清汁发酵，果浆发酵溶解了苹果中全部的营养成分，弥补苹果清汁发酵过程中微量元素不足的缺点[12]。利用苹果浆进行发酵，充分利用苹果果肉资源，更大程度地保留苹果的原始风味，这不仅提高原料的利用率，而且其营养成分也得到良好的保留和细化[13]，特别是苹果浆中丰富的维生素、多酚、多糖及多种有机酸等成分，大大提高其营养价值、保健功能及风味特性[12]，而且活菌数也得到一定提高。安兴娟等[14]优化植物乳杆菌发酵枸杞胡萝卜汁工艺条件，但仅以感官评分作为单一评价指标。此外，风味是影响发酵食品品质的重要因素。李海萍等[15]研究乳酸菌发酵果蔬汁前后有机酸、氨基酸、总膳食纤维、B族维生素营养成分的变化，但并未从风味化学的角度进行分析。

本研究利用乳酸菌（植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌）混菌发酵苹果浆，以发酵后苹果浆的活菌数和感官评分为综合评价指标，在单因素试验基础上，采用正交试验优化乳酸菌发酵苹果浆的工艺条件，旨在开发一种集营养、保健与良好风味于一体的功能型乳酸菌果蔬饮料。通过分析苹果浆经乳酸菌前后的挥发性风味成分变化，为进一步研究发酵苹果浆的化学风味提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

益生菌菌种：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CICC 21805、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）CICC 20250，均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保存于西北农林科技大学食品科学与工程学院健康食品制造与安全控制实验室。

苹果：红富士，购于陕西杨凌超市，大小均一，无磕碰、烂果。

MRS肉汤培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂 美国Solarbio公司；氯化钠（分析纯）四川西陇化工有限公司；抗坏血酸 西陇科学股份有限公司；果胶酶 上海源叶生物科技有限公司；中温淀粉酶 湖南鸿鹰祥生物工程股份有限公司；氢氧化钠（分析纯） 广东省化学试剂工程技术研究开发中心。

1.2 仪器与设备

HR2096型飞利浦搅拌机 飞利浦电子（香港）有限公司；YXQ-LS-70A型立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DK-98IIA型电热恒温水浴锅 上海沪粤明科学仪器有限公司；涡旋振荡器美国Scientific Industries公司；YT-CJ-2ND型超净工作台北京亚泰科隆仪器技术有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；ZXSD-A1160型生化培养箱 上海智诚分析仪器制造有限公司；50/30 μm PDMS/DVB自动固相微萃取进样器 美国Supelco公司；120150-T230L气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 苹果浆的制备

挑选→清洗→去皮、去核→加蒸馏水和0.15%抗坏血酸→匀浆→果胶酶和淀粉酶酶解→钝化酶→冷冻待用

1.3.2 苹果浆发酵

将甘油管保存的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，36 ℃静置培养18 h，活化2 代。用120 g/L NaOH溶液将苹果浆pH值调为5.9[16]，100 ℃灭菌15 min，置于超净工作台上冷却至室温。取1 mL经活化后的乳酸菌发酵剂（菌浓度9.0（lg（CFU/mL））），10 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入1 mL苹果浆悬浮乳酸菌。重悬乳酸菌按不同比例及接种量接入苹果浆中，置于36 ℃静置发酵48 h后，于4 ℃冷藏24 h[17]。

1.3.3 活菌数的测定

根据GB 4789.35—2010《食品微生物学检验 乳酸菌检验》进行乳酸菌计数。

1.3.4 感官评价[18]

挑选10 名有深厚专业背景的老师及学生，分别对复合乳酸菌发酵苹果浆进行感官评价，具体评分细则见表1。

表 1 益生菌发酵苹果浆感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented apple pulp with probiotics

1.3.5 香气成分富集及测定

根据李维妮等[8]测定方法稍作改进。

采用顶空固相微萃取（head-space solid phase microextraction，HS-SPME）进行香气成分的富集。用移液枪准确移取5 mL样品于20 mL进样瓶中，加入1.5 g氯化钠，上机测定。进样瓶先在45 ℃平衡30 min，再用老化过的萃取头插入进样瓶中，顶空吸附30 min，然后进行解析测定。

1.3.5.1 色谱条件

色谱柱：DB-17MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；自动进样，进样口温度250 ℃，载气为He，流速为1.93 mL/min，不分流进样。升温程序：起始温度40 ℃，保持3 min后以4 ℃/min速率升温至120 ℃，再以6 ℃/min速率升温至240 ℃，保持9 min。

1.3.5.2 质谱条件

电子电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度230 ℃，质量扫描范围m/z 35～500。

1.3.5.3 定性定量方法

定性分析：利用气相色谱-质谱联用Postrun Analysis分析软件和NIST14质谱数据库检索对比，根据相似度（大于80）和保留时间对各个物质进行分析，确定各色谱峰对应的香气成分及结构。定量分析：根据色谱图保留峰面积计算各个香气成分的相对含量，每个样品重复3 次取平均值。

1.3.6 单因素试验

1.3.6.1 料液比对发酵苹果浆品质的影响

将料液比为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1（g/mL）苹果浆，经100 ℃、15 min灭菌后，按接种量3%，菌种比例植物乳杆菌-嗜酸乳杆菌1∶1（体积比，下同）接种于苹果浆后，于36 ℃静置发酵48 h，分别测定其活菌数并进行感官评分。

1.3.6.2 发酵温度对发酵苹果浆品质的影响

将料液比2∶1（g/mL）苹果浆，经100 ℃、15 min灭菌后，按接种量3%，菌种比例植物乳杆菌-嗜酸乳杆菌1∶1接种于苹果浆后，分别于24、28、32、36、40 ℃静置发酵48 h，分别测定其活菌数并进行感官评分。

1.3.6.3 接种量对发酵苹果浆品质的影响

将料液比2∶1（g/mL）苹果浆，经100 ℃、15 min灭菌后，按接种量1%、2%、3%、4%、5%，菌种比例植物乳杆菌-嗜酸乳杆菌1∶1接种于苹果浆后，于36 ℃静置发酵48 h，分别测定其活菌数并进行感官评分。

1.3.6.4 发酵时间对发酵苹果浆品质的影响

将料液比2∶1（g/mL）苹果浆，经100 ℃、15 min灭菌后，按接种量3%，菌种比例植物乳杆菌-嗜酸乳杆菌1∶1接种于苹果浆后，于36 ℃静置发酵24、36、48、60、72 h，分别测定其活菌数并进行感官评分。

1.3.6.5 菌种比例对发酵苹果浆品质的影响

将料液比2∶1（g/mL）苹果浆，经100 ℃、15 min灭菌后，按接种量3%，菌种比例植物乳杆菌-嗜酸乳杆菌4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4接种于苹果浆后，分别于36 ℃静置发酵48 h，分别测定其活菌数并进行感官评分。1.3.6.6 灭菌条件对发酵苹果浆品质的影响[19]

将料液比2∶1（g/mL）苹果浆，分别经100 ℃、15 min，100 ℃、5 min，90 ℃、15 min，90 ℃、5 min，80 ℃、15 min，80 ℃、5 min灭菌后，按接种量3%，菌种比例按植物乳杆菌-嗜酸乳杆菌1∶1接种于苹果浆后，分别于36 ℃静置发酵48 h，分别测定其活菌数并进行感官评分。

1.3.7 复合乳酸菌发酵苹果汁工艺正交优化试验

在单因素试验基础上，选取发酵温度、发酵时间、接种量、菌种比例作为自变量，以活菌数和感官评分为评价指标，设计L9（34）正交试验，采用双目标优化，因素与水平见表2。

表 2 发酵工艺正交试验L9（34）设计Table 2 Coded levels and actual levels of independent variables used in orthogonal array design

1.4 数据分析

通过SPSS 16.0软件，采用聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）研究苹果浆经乳酸菌发酵前后挥发性风味物质的变化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对益生菌发酵苹果浆品质的影响

图 1 料液比对发酵苹果浆品质的影响Fig. 1 Effect of apple pulp to water ratio on the quality in fermented apple pulp

由图1可知，随着料液比的增大，其活菌数呈递增的趋势，料液比为2∶1（g/mL）时，感官评分达到最大值，其风味和组织状态均很好，料液比为3∶1（g/mL）苹果浆由于其组织状态较黏稠，因此乳酸菌发酵苹果浆的最佳料液比为2∶1（g/mL）。

2.1.2 发酵温度对益生菌发酵苹果浆品质的影响

图 2 发酵温度对发酵苹果浆品质的影响Fig. 2 Effect of fermentation temperature on the quality in fermented apple pulp

由图2可知，随着温度的升高，活菌数和感官评分均呈现先上升后下降的趋势，在发酵温度32 ℃时，活菌数最高；36 ℃时感官评分最高。综合判断正交优化试验发酵温度选取32、36、40 ℃。

图 3 接种量对发酵苹果浆品质的影响Fig. 3 Effect of inoculum size on the quality of fermented apple pulp

2.1.3 接种量对益生菌发酵苹果汁品质的影响由图3可知，随着接种量的增大，活菌数呈现先上升后下降的趋势，主要原因是接种量过低，发酵时间较长，而且容易污染杂菌，不仅影响产品的风味同时也会抑制乳酸菌的生长，导致活菌数降低；接种量过高，发酵速度太快，导致微生物细胞易衰老，出现自溶现象，影响发酵苹果浆的风味[20]。在接种量为3%时，其活菌数达到最大值。接种量为2%时，感官评分达到最大值，综合判断正交优化试验接种量选取2%、3%、4%。

2.1.4 发酵时间对益生菌发酵苹果浆品质的影响

图 4 发酵时间对发酵苹果浆品质的影响Fig. 4 Effect of fermentation time on the quality of fermented apple pulp

由图4可知，随着发酵时间的延长，活菌数和感官评分均呈现先上升后下降的趋势。发酵时间过短，发酵力不足，导致发酵后的苹果浆果蔬味较明显；发酵时间过长，会产生更多的乳酸，抑制乳酸菌的生长。在发酵时间48 h时，活菌数和感官评分均达到最大值，综合判断正交优化试验发酵时间选取36、48、60 h。

2.1.5 菌种比例对益生菌发酵苹果浆品质的影响

由图5可知，随着植物乳杆菌比例的减小，发酵苹果浆的活菌数和感官评分均呈先上升后下降的趋势。当两者比例为3∶1时，其活菌数达到最大值，而且其感官评分也达到最大值，综合判断正交优化试验发酵菌种比例选取4∶1、3∶1、2∶1。

2.1.6 灭菌条件对益生菌发酵苹果浆品质的影响

图 6 灭菌条件对发酵苹果浆品质的影响Fig. 6 Effect of sterilization conditions on the quality of fermented apple pulp

如图6所示，随着灭菌程度的减弱，其活菌数和感官评分均呈下降趋势，当灭菌条件为90 ℃、15 min，90 ℃、5 min，80 ℃、15 min，80 ℃、5 min时，其风味呈现刺激性的酸臭味，主要是由于杀菌不彻底，杂菌生长，导致发酵失败造成的。100 ℃、15 min时，其活菌数和感官评分均达到最大值，综合判断100 ℃、15 min为最佳灭菌条件。

2.2 复合乳酸菌发酵苹果浆工艺正交优化试验

由表3可知，对益生菌发酵苹果浆活菌数影响因素依次：发酵温度＞发酵时间＞接种量＞菌种比例。由表4可知，发酵温度对益生菌发酵苹果浆的活菌数影响显著。而对益生菌发酵苹果浆感官评分影响因素依次：接种量＞菌种比例＞发酵温度＞发酵时间。方差分析结果表明，乳酸菌接种量和菌种比例对益生菌发酵苹果浆的感官评分影响显著。综合考虑，选择最优水平为发酵温度32 ℃、接种量2%、菌种比例4∶1，由于发酵时间对活菌数和感官评分都不具有显著性，且极差较小，结合正交试验结果和单因素试验结果综合考虑，选择发酵时间为36 h。在此条件下发酵得到的益生菌发酵苹果浆活菌数为8.93（lg（CFU/mL）），感官评分为92，口感细腻、组织均匀、酸甜可口，富有浓郁的苹果芳香及发酵香。

表 3 益生菌发酵苹果浆的正交试验设计与结果Table 3 Orthogonal array design with dependent variables

表 4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.3 发酵前后苹果浆风味变化

从表5可以看出，苹果浆发酵前有23 种挥发性风味物质，其中醇类3 种、酯类8 种、醛类8 种、酮类1 种等。发酵后的苹果浆中有12 种风味物质与发酵之前相同，新生成15 种风味物质，以酯类和醇类为主。其中，乙醇被赋予苹果甜香的风味特征[24-25]，乙酸乙酯被赋予果香和酯香属性[26]，2-壬酮被赋予香味属性特征[25]。

醇类物质是微生物通过氨基酸代谢产生的[28]，酯类物质具有水果香[22]，由于酯类物质的风味阈值较低，气味活度值相比其他物质较高，所以对发酵风味的贡献较大。酯的生物合成主要是以下两条途径：一是酯化，醇类和有机酸在酯酶的作用下生成酯类物质[27]；二是醇解，醇类和甘油酯或乙酰辅酶A在酰基转移酶或酯酶的作用下合成酯类物质[29]。高浓度的醛类物质会带来异味[21]，而且醛类物质是不稳定的化合物，特别是在微生物作用下，在食品基质中被还原为醇或被氧化为酸[23]，这可以解释发酵后的苹果浆中醛类物质相对含量低而醇类物质相对含量高，分别为5.11%和39.92%。脂肪酸的风味特征是一种不愉快的肥皂味，但它们可以作为酯类物质形成的前体物质[22]。苹果浆经益生菌发酵后醇类、酮类和酯类风味物质相对增加，醛类风味物质降低，说明酯类、酮类和醇类化合物之间的平衡对于发酵苹果浆的风味有重要影响。

表 5 发酵前后苹果浆挥发性风味成分Table 5 Volatile components of apple pulp before and after fermentation

2.4 HCA

HCA是一种无监督模式识别方法，常用于样品分类，分类前不清楚样品的分类信息，且不需要输入其他任何信息[30]。采用HCA以评估发酵前和发酵后果浆中挥发性化合物的变化。通过SPSS 16.0分析软件，以类间平均距离法作为测量方法，以欧式距离作为度量标准，将发酵苹果浆和未发酵苹果浆样品风味物质聚类成树状图。

图 7 聚类分析树状图Fig. 7 Cluster analysis dendrogram

由图7可知，发酵苹果浆和未发酵苹果浆样品分别被准确聚为一类：一种聚类对应于发酵前的苹果浆样品（nferm）；另一种聚类对应于发酵后的苹果浆样品（ferm）。当欧式距离增大至25.0时，发酵样品和未发酵样品才被聚为一类，说明发酵样品和未发酵样品之间相似度极低。表明发酵前和发酵后的整体挥发性风味轮廓不同，经益生菌发酵后的苹果浆风味改变显著。

3 结 论

以植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌为发酵菌株，建立乳酸菌混菌发酵苹果浆的最佳工艺条件为发酵温度32 ℃、发酵时间36 h、接种量2%、菌种比例4∶1、苹果浆料液比2∶1（g/mL），灭菌条件100 ℃、15 min。在此条件下，发酵得到的益生菌发酵苹果浆活菌数为8.93（lg（CFU/mL）），感官评分为92。

经气相色谱-质谱分析检测，苹果浆经乳酸菌发酵前后分别检测出23 种和27 种挥发性风味物质，发酵后新增加15 种风味物质，主要是乙酸乙酯、乙酸丁酯、2-庚酮、2-壬酮、1-己醇等。正是这些新增加的挥发性风味物质之间相互协调与平衡构成乳酸菌发酵苹果浆的独特风味。

经HCA表明，发酵苹果浆和未发酵苹果浆样品均被准确分类，苹果浆经乳酸菌发酵后风味改变显著。此外，乳酸菌发酵苹果浆的特征风味物质不仅取决于风味物质的种类和含量，同时还与其风味特征、阈值相关，须通过嗅辨仪结合气相色谱-质谱以及气味活度值法综合分析乳酸菌发酵苹果浆的特征风味物质。因此，乳酸菌发酵苹果浆的特征风味物质还有待进一步研究。