银-铜/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极测定当归中的阿魏酸

叶鸿清，赖木深，朱明芳，梁焕如，梁学彬

(广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

阿魏酸即3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗紫外线辐射、抗自由基和人体免疫系统调节等药理活性，在疾病预防和治疗中起着重要的作用[1-3]。目前，阿魏酸在临床上主要用于治疗冠心病、脑血管阻塞、血管炎以及白细胞和血小板减少等疾病，另外在保健食品、化妆品和营养补充剂中也有重要应用[4]。常用的阿魏酸测定方法包括薄层色谱法[5]、高效液相色谱法[6]、毛细管电泳法[7]、荧光分光光度法[8]、电化学测定法[9-10]等。电化学方法因具有高灵敏度和低成本等优点，在药物、染料、杀虫剂和无机物检测上引起了极大的关注。文献报道的阿魏酸电化学测定主要应用的是其氧化峰，本课题组也曾用碳糊电极阴极溶出伏安法测定阿魏酸的氧化峰[11]。用双金属纳米颗粒负载还原的氧化石墨烯复合材料修饰的玻碳电极测定阿魏酸的还原峰的研究未见文献报道。

银-铜双金属纳米颗粒具有电化学催化作用，已被用于许多无酶电化学传感器的研究中[12]。但金属纳米材料容易发生聚集，会大大降低其电化学性能，因此限制了其使用。据文献报道，金属纳米颗粒与还原氧化石墨烯组成的复合材料，不仅具有金属本身的性能，而且可使还原的氧化石墨烯片层间距增大，优化了石墨烯单层的独特性能；同时，还原氧化石墨烯和无机纳米粒子能产生协同效应，具有潜在应用价值[13-15]。

本文将合成的银-铜双金属/还原氧化石墨烯复合材料修饰在玻碳电极上，在0.30 V处测定阿魏酸的还原峰，建立了测定当归中阿魏酸的新方法。修饰的玻碳电极对阿魏酸有较好的电化学响应，响应快、灵敏度高，也有望用于其他中药中阿魏酸质量分数的测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

CHI1242B型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；三电极系统：玻碳电极(直径3 mm)及修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极；KQ-50E型超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；pHS-25型pH计(上海智光仪器仪表有限公司)。

1.2 试药

阿魏酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：1517121，质量分数为99%)；CuSO4·5H2O(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；AgNO3(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氧化石墨烯(苏州碳丰科技有限公司)；NaBH4(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；当归(广东逢春制药有限公司，批号分别为190201A03、190201A04、190201A05)；其他试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸10.0 mg，用5 mL无水乙醇超声溶解，加水定容于50 mL的容量瓶中，得到浓度为1.03 mmol/L阿魏酸对照品储备液。精密移取适量储备液，用B-R缓冲溶液(pH 5.96)稀释，得到一系列不同浓度的阿魏酸对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称定当归粉末(过三号筛)0.2 g，置于具塞锥形瓶中，加入无水乙醇20 mL，密塞、称定质量，于45 ℃加热回流30 min，放冷，加入无水乙醇补足减少质量，摇匀后静置，取上清液，滤过，取续滤液即为供试品溶液。

2.2 银-铜双金属/还原氧化石墨烯复合材料的合成

参考文献[14]称取CuSO4·5H2O 0.250 0 g和AgNO30.169 9 g于三颈瓶中，依次加入20 mL去离子水、10 mL氧化石墨烯水溶液(1.0 mg/mL)、10 mL柠檬酸钠(0.02 mol/L)，加热到25 ℃后持续搅拌反应30 min。然后逐滴加入0.2 mol/L的NaBH4溶液20 mL，25 ℃下继续搅拌反应1 h。反应完成后静置冷却至室温，再用去离子水和无水乙醇清洗抽滤3次，将所得固体置于25 ℃烘箱中，直至完全干燥，所得产物存放在4 ℃冰箱中，备用。同法制备不含还原氧化石墨烯的银-铜双金属纳米颗粒。

2.3 银-铜双金属/还原氧化石墨烯修饰电极的制备

将玻碳电极分别用2.5、0.5 μm Al2O3浆料抛光直至镜面，再依次用水和乙醇超声处理，在室温下空气中干燥，得到预处理的玻碳电极(GCE)。取合成的银-铜双金属/还原氧化石墨烯复合材料0.5 mg于1 mLN，N-二甲基甲酰胺溶剂中，超声溶解1 h，吸取此溶液10 μL滴涂于预处理后的玻碳电极上，所制备的修饰电极用Ag-Cu@rGO/GCE表示。同法制备银-铜双金属纳米颗粒修饰的玻碳电极(Ag-Cu/GCE)、还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极(rGO/GCE)。

2.4 电化学测量方法

在pH 5.96的B-R缓冲溶液中，以自制的修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，用差分脉冲伏安法测定阿魏酸浓度与对应电流的线性关系，得出检出限。同时对修饰电极进行精密度、重复性、稳定性、选择性测试，最后进行样品测定。差分脉冲伏安法的条件为：初始电位0.1 V，终止电位0.7 V，电位增量0.01 V，脉冲幅度0.05 V，脉冲宽度0.05 s。

2.5 不同电极的电化学交流阻抗

GCE和Ag-Cu@rGO/GCE在5.0 mmol/L铁氰化钾溶液中的交流阻抗图谱见图1。

a. Ag-Cu@rGO/GCE; b.GCE。

图1不同电极的电化学交流阻抗图

Figure1Electrochemical AC impedance diagram of different electrodes

在阻抗图谱中，半圆的直径在数值上等于电极的电荷转移电阻(Ret)[16]。由图1可知，GCE比Ag-Cu@rGO/GCE的电阻大，说明在电极表面上修饰银-铜双金属/还原氧化石墨烯复合材料能降低电极阻碍电子传递的能力，并提高电极的电催化性能。

2.6 差分脉冲伏安法测定当归中的阿魏酸

2.6.1 线性关系及检测限 按照“2.1.1”项下方法分别配制浓度为1.03×10-7、4.12×10-7、6.18×10-7、1.03×10-6、2.06×10-6、6.18×10-6、8.24×10-6mol/L的阿魏酸对照品溶液，按“2.4”项下方法对不同浓度的阿魏酸进行测定，结果见图2。可见，阿魏酸的浓度在0.103～8.24 μmol/L时，峰电流随着浓度的增大而增大，并且存在良好的线性关系，线性方程为Ipc=2.670 9c+3.434 9(其中：Ipc为峰电流，μA；c为阿魏酸浓度，μmol/L)，r=0.998 4，检测限为0.033 μmol/L(S/N=3)

2.6.2 选择性试验 按“2.1”项下方法配制1.03 μmol/L的阿魏酸对照品溶液，按“2.4”项下方法进行干扰实验。结果显示，10倍浓度的芥子酸、熊果酸、香草酸等酸性物质对阿魏酸测定几乎没有干扰，50倍浓度的常见无机离子，如Mg2+、Co2+、Cu2+、K+、Mn2+、Fe3+以及SO42-，对测定几乎无影响，说明该修饰电极对阿魏酸有良好的选择性。

2.6.3 精密度试验 按“2.1.1”项下方法配制5.15 μmol/L的阿魏酸对照品溶液，按“2.4”项下方法连续测定7次，结果测得峰电流的RSD值为1.2%，表明方法精密度良好。

a～g：阿魏酸溶液浓度依次为1.03×10-7、4.12×10-7、6.18×10-7、1.03×10-6、2.06×10-6、6.18×10-6、8.24×10-6mol/L。

图2不同浓度的阿魏酸在Ag-Cu@rGO/GCE的差分脉冲伏安图(插入图：阿魏酸的浓度与还原峰电流的校正曲线图)

Figure2Differential pulse voltammogram of different concen-trations of ferulic acid in Ag-Cu@rGO/GCE (Inset: Calibration curves of ferulic acid concentration and reduction peak current)

2.6.4 重复性试验 按“2.1.2”项下方法配制供试品(批号：190201A03)溶液6份，按“2.4”项下方法进行测定，结果测得阿魏酸的平均质量分数为0.782 0 mg/g，RSD值为2.2%，表明方法重复性良好。

2.6.5 稳定性试验 按“2.1.2”项下方法配制供试品(批号：190201A03)溶液，按“2.4”项下方法连续5 d用差分脉冲伏安法测定，测得峰电流的RSD值为3.4%，表明方法稳定性良好。

2.6.6 回收率试验 精密称取同一批次(批号：190201A03)当归粉末0.2 g，共6份，分别精密加入阿魏酸对照品高、中、低3个浓度的对照品溶液，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，根据“2.4”项下方法用Ag-Cu@rGO/GCE进行回收率测定。

作为比较，同时采用HPLC法[17]进行回收率测定，色谱条件如下：色谱柱为YMC-Triart C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-5%磷酸水溶液(体积比为25∶75)，紫外检测波长为316 nm。

结果显示，电化学法测定的平均加样回收率为104.3%，HPLC法测得的平均加样回收率为100.8%，且RSD均小于2%，见表1。

2.6.7 样品分析 取3个批号当归样品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，根据“2.4”项下方法用Ag-Cu@rGO/GCE对供试品中的阿魏酸进行电化学测定，同时采用HPLC法[17]测定进行比较。结果显示，3批当归中阿魏酸的质量分数在0.773 6～0.786 4 mg/g之间，见表2。

表1 当归中阿魏酸的加样回收率测定结果Table 1 Determination of the recovery of ferulic acid in Angelica sinensis (n=3)

表2当归中阿魏酸的质量分数测定结果

Table2Determination results of the content of ferulic acid inAngelicasinensis(n=3)

批次测定方法w(阿魏酸)/(mg·g-1)RSD/%190201A03Ag-Cu@rGO/GCE0.773 63.2HPLC法0.786 32.7190201A04Ag-Cu@rGO/GCE0.780 33.3HPLC法0.786 43.0190201A05Ag-Cu@rGO/GCE0.779 14.2HPLC法0.785 11.4

3 讨论

3.1 化学修饰电极的选择

本研究分别比较了阿魏酸在GCE、Ag-Cu/GCE、rGO/GCE、Ag-Cu@rGO/GCE电极上的差分脉冲伏安曲线，结果见图3。可见，阿魏酸在Ag-Cu@rGO/GCE上的还原峰峰电流值最大，并且峰形也更好。因此，本研究选用Ag-Cu@rGO/GCE电极。

a. GCE; b.Ag-Cu/GCE; c.rGO/GCE; d.Ag-Cu@rGO/GCE。

图31.03×10-4mol/L阿魏酸在不同电极上的差分脉冲伏安图

Figure3Differential pulse voltamogram of 1.03×10-4mol/L ferulic acid at different electrodes

3.2 pH的选择

本研究考察了不同pH值对阿魏酸电化学行为的影响，结果显示，当pH小于5.96时，峰电流随着pH的增大不断增大，并在pH=5.04处达到最大值，之后随着pH的增大不断减小。另外，在碱性的环境中阿魏酸无法获得较好的还原峰，故选择pH 5.96的B-R缓冲溶液为测定阿魏酸的底液。

在Ag-Cu@rGO/GCE电极上，阿魏酸的还原峰电位(Epc)与pH值成线性关系，线性方程为Epc=-0.052 8pH+0.566 8，r=0.994 1。该方程的斜率-0.052 8，接近理论值-0.059，说明阿魏酸的电化学还原反应是等质子等电子的反应。

3.3 扫描速度的选择

本研究考察了扫描速度对阿魏酸电化学行为的影响，结果显示，随着扫描速度的增加，还原峰峰电流也随之增大，且电位负移；但扫描电压过高时，充电电流过大，还原峰峰形变差，不利于峰电流的测定。在获得较大峰电流同时又要防止充电电流过大，故选择扫描电压为0.1 V/s。

在Ag-Cu@rGO/GCE电极上，阿魏酸的还原峰电流(Ipc)与扫描速度(ν)的线性方程为：Ipc= -134.61ν+2.111 2(r=0.996 4)，表明阿魏酸在修饰电极表面的还原过程受吸附控制。根据Laviron方程[18]可计算转移电子数n=1.86，说明阿魏酸在修饰电极上的电化学还原为双电子双质子过程。

3.4 Ag-Cu@rGO/GCE法与HPLC法的比较

修饰电极由于具有更高的灵敏度和选择性，在中药成分的电化学分析中用途广泛。本文所建立的阿魏酸电化学测定方法与HPLC法[17]比较，在回收率及质量分数测定结果方面的差异均不显著，且满足中药成分分析的要求，表明本方法可用于当归中阿魏酸的测定。

本研究制备的Ag-Cu@rGO/GCE电极对阿魏酸有较好的选择性和稳定性，但也还存在线性范围不够宽、检测限不够低等问题，在后续的研究中应对电极进一步优化，改善电极的性能缺陷，以便更好地适应中药复杂成分中目标物的测定。