酱油和食醋香气成分的测定及生产工艺鉴定研究

隋明，张凤英，唐贤华，吴霞，王静霞，牛广财

(1.四川工商职业技术学院，四川 都江堰 611830;2.四川大学 轻纺与食品学院， 成都 610065；3.奥克兰大学 医学与健康科学学院，新西兰 奥克兰 1052)

酱油和食醋已经是现代生活中人们在烹饪菜肴时必不可少的2种调味品，随着生活水平的提高，在满足卫生标准的前提下其丰富的香气和口感提升了菜品的口味。酱油和食醋的另一个功能是增加食物的营养成分，进一步提升食欲，甚至目前已经出现了保健醋、低盐酱油等[1，2]。通过了解酱油和食醋的生产情况与发酵技术，可以进一步了解这2种物质的香气成分，对其测定和技术鉴定具有一定帮助。

1 酱油、食醋概述

1.1 酱油概述

史游《急就篇》中有关于古人将大豆、小麦作为基础原料制作豆酱的记录；《齐民要术》中也有关于酱油生产的很多记载；另外，孙思邈《千金方》中也有关于使用酱油治疗疾病方面的医疗方法[3]。酱油是以大豆、小麦为主要原料以及麸皮、稻壳等副产品为辅料经过制曲、发酵、蒸煮后产生的一种液体调味产品。我国的大豆栽培种植产业以及相关加工行业的历史发展幽远流长，而酱油作为中华民族最为传统的大豆制品，在调味品方面具有十分深厚的基础。有文献显示，中国酱油的起源应该是豆酱，最早有关酱油的典籍也可以追溯至西汉。现今我国已经成为酱油产销量最高的国家，年产量超过500万吨，从品种、花色和档次等方面都呈现出百花齐放的态势。中国酱油从产地可以划分四类，分别是广东海天酱油，粤产酱油，李锦记等外资酱油，沪产酱油。

有关酱油、食醋根据挥发性组分确定不同品类、级别的研究技术，研究水平相对滞后，目前更多的将研究侧重点放在提高蛋白质利用度以及缩短酿造时间两方面，而不同工艺、微生物群落对有关香气成分分析方面的研究不足[4，5]。

1.2 食醋概述

食醋作为一种主要调节酸性口感的调味品，按照生产方式可以分为酿造食醋(价格高)和配制食醋(醋精勾兑而成，价格便宜)。酿造食醋的主要原料是富含淀粉的粮食作物，南方主要以大米、糯米为主，而北方主要以高粱和小米为主。随着技术的发展，对食醋口味、香气的要求提高，现代酿造食醋都需要加入粮食作物辅料，如马铃薯、番薯、红薯、木薯等，通过淀粉糖化、乙醇发酵以及醋酸发酵等程序，最终形成具有酸、甜、咸、鲜味道的调味品。目前也出现了很多保健醋，比如抗氧化、抗菌、抗肿瘤、降低体脂、减少胆固醇[6-8]以及增加其他保健功能性物质的食醋。

食醋产生时间久远，可以与酿酒历史相提并论，正是在反复酿造酒质变酸的过程中人类开始掌握了酿醋技艺。本研究在对食醋香气成分分析过程中鉴定了相应产品中出现的多种特征型指纹峰物质中，确定了不同品类食醋的指纹图谱，基于固相微萃取方式可以对传统样品类型进行技术处理，基于此建立更加完善的食醋香气检测、加工工艺以及不同微生物群落对食醋风味的影响[9]，以期对未来食醋酿造工艺水平提升提供帮助。

2 材料及仪器

2.1 实验材料

酱油样品：阆中阆州手工酱油、古龙古早酱油、欣和六月鲜生抽、配制酱油等；

食醋样品：陕西宁化府老陈醋、欣和醯官醋、四川阆中手工醋、北京米醋、配制食醋等。

2.2 试剂

4-乙基愈创木酚、糠醇和羟基-2-(5)-乙基-5-(2)-甲基-3(2)呋喃酮：均为色谱纯,购于中国上海生工集团。

主要仪器包括：气相色谱仪(GC-88900)、气质联用仪(GC-MS-6800)、水浴锅、旋转蒸发器、微量进样器(10 μL)等。

本研究中选取的玻璃器皿采用二次回收有机溶剂进行洗涤，并对器皿残留物进行去除，随后使用洗衣粉溶剂采取浸泡方式，去除表面残留杂质和油渍等物质。随后，使用2%盐酸、重铬酸钾溶液进行浸泡(2 h)，最后使用蒸馏水进行冲洗。使用烘箱在110 ℃条件下烘干(4 h)后备用。其他器材也采用相同方法进行处理，并倒置晾干。

3 酱油及食醋香气成分测定分析

3.1 萃取头老化

实验中，在使用萃取头前应当进行老化处理，采取85 μm PA和100 μm PDMS进行老化处理，时长设定为2 h，温度条件为250 ℃。

3.2 色谱条件分析

本实验中使用的色谱柱是PEG-20M弹性石英毛细管柱，设置初始柱温为55 ℃，且在恒温2 min条件下以3.5 ℃/min将温度重新提升到120 ℃，维持1 min，随后以6 ℃/min将温度提升至200 ℃，并维持温度。使用的载气为高纯氮，氢气流量调整为20 mL/min，空气流量应控制在300 mL/min，经过FID检测，进样口温度应达到230 ℃，且不存在分流模式。

质谱条件：EI源，EMV 800 V，此时的扫描范围应当达到33～300 amu，电子能量需要达到70 eV,并通过全扫描方式完成。

3.3 酱油、食醋的香气成分测定

3.3.1 内标物的设计

在选择过程中应当把握几点原则：样品中不包含此类化合物；内标的选择需要与对应的化学分子之间具有空间结构或者类别具有相似性；内标峰以及被测峰出峰时间具有相近特征。

通过测试，乙酸正戊酯设定为内标，此时选择乙酸正戊酯含量2 mL，将其添加入100 mL容量中，并采用乙醇(60%含量)定容，此时可以获得内标物175.8 mg/L的浓度含量。

3.3.2 酱油混合标准溶液配制和校正因素测量分析

根据前人的经验，酱油香气组分中乙醇含量较高，且香气成分标样显示无法与水相融，则此时20%的乙醇溶液作为基质，可以完成标准溶液的配制。此时，选定20种香气组，每组组分选择其中50 μL，添加入100 mL容量瓶中进行定容，并完成储备液的配比制作，形成0.5 mL/L比例的溶液。

在校正因子过程中，需对储备液进行10倍稀释，则此时标准液浓度是0.05 mL/L。

将乙酸正戊酯作为内标，同时将内标物和标样混合，获得1 μL添加入10 mL酱油样品中，此时可以通过相对校正因素赋值方式进行计算。

3.3.3 食醋标样配制

通常而言，总酸在食醋中的含量能够达到3.5 g/mL，而更多的是乙酸，几乎可以达到食醋中绝对比例，为了能够保证食醋标准样品中成分一致，选择乙酸溶液作为溶剂完成配比。本次实验选择24种香气组分，并每组取样50 μL，采取3.5 mL/dL的乙酸溶剂定容。

3.3.4 酱油和食醋香气成分定性分析

本次研究中主要选择的是气相色谱-质谱定性分析方式，确定了匹配度高于85%，采取标样核对方式对定性结果进行确认，并通过内标法完成定量。

3.3.5 酱油、食醋香气成分定量分析

本次实验中将不同品牌的酱油、食醋抽样中挥发性组分进行含量计算，依据组分峰面积以及内标峰面积的测定，计算出各组分中挥发性组分实际含量情况。

图1 酱油取样气相色谱图Fig.1 Sampling gas chromatography of soy sauce

图2 食醋取样气相色谱图Fig.2 Sampling gas chromatography of vinegar

4 酱油和食醋生产工艺鉴定与质量控制

为确保实验的规范性与数据的准确性，本实验针对样品中挥发性组分的数据分析，均充分依据质量保证与质量控制标准体系。在具体执行过程中控制几个方面的工作，质量保证实施需要建立具有可行性的操作系统，确保数据的准确与严格，目的是能够对使用者提供准确的标准。为此，在提取酱油和食醋挥发性组分过程中应当提取彻底，严格按照顶空提取操作完成，确保正确的操作流程，对样品的采集及有效保管，针对仪器设备的有效维护，对人员组织相关负责人的结构搭配等。质量控制过程中包括了对过程和数据的控制。数据质量目标则需要充分考虑精密度、准确性、代表性和完整性。

4.1 样品前处理流程工艺控制

针对确定样品前的处理操作规范如下：依据相关流程实施萃取富集、分离纯化以及浓缩定容操作。另外，对不同目标化合物则需在不同环境基质条件下进行不同技术处理，例如在对饮用水样品进行处理过程中，通常省略纯化操作，而是脱水处理。结合目标化合物可以选择替代化合物，确定更加符合实际需要的替代化合物类型；前提应当是非目标化合物，环境样品中包括了罕有的检出类型，物质结构需相似，最好是同位素标定。方法空白则具体是指实验室试剂以及现场试剂空白，LRB需要对空白水样本实施实验，且在实验过程中主要依据的是国家重点实验样品具体的操作规范，其中包括了对各类型器皿，如玻璃瓶、仪器设备等。在检测实验室中的样品相关操作流程也需要考虑使用目标化合物和相关分析，FRB则需要通过对空白水样的采集和依据整个样品前处理操作办法执行具体流程，其中包括对样点采集、运输和相关流程的分析。

4.2 仪器分析阶段的工艺控制分析

需增加内标化合物。依据目标化合物可以增加一定的内标化合物，但是此类内标化合物不能与目标化合物的性质相似。本次研究中酱油和食醋香气成分主要采取乙酸正戊酯作为主要的内标化合物，为此，测定相对校正因子的过程中，对所有分析样品均需要进行添加。

校正质量控制分析。在对样品进行技术分析之前，需采取校正空白操作，也就是溶剂空白处理，对前一日工作中产生的样品杂质进行处理，确保实验中不再出现杂质。

随后，通过内标峰面积方法构建校正曲线，此时在进行检验的过程中RF值所产生的相对偏差不应当高于20%。此外，还需要进行日校对，并进行校正审核。使用已经建立的校正曲线测定标准溶液，如果偏差高于20%，则日校正不符合标准，还应重新校对校正曲线。

5 结果与讨论

通过使用内标法确定的内标曲线图见图3，相关系数达到0.9990，符合标准，数据准确。不同品牌的食醋共有的挥发性组分数据见表1，王芮东等[10]使用HPLC测定食醋中的有机酸成分，结果显示：陈醋、香醋中的有机酸种类要比果醋中的成分更加丰富。

图3 内标校正曲线的建立Fig.3 Establishment of calibration curve for internal standard

表1 食醋中挥发性组分的含量Table 1 Content of volatile compounds in vinegar

注：“*”表示单位为mg/mL。

Castro Mejías R等[11]采用顶空固相微萃取技术对醋中芳香化合物进行分析。结果表明：包覆羧基-聚二甲硅氧烷的二氧化硅纤维比包覆聚二甲硅氧烷、碳-二乙烯基苯、聚二甲硅氧烷-二乙烯基苯的二氧化硅纤维具有更好的萃取效果，但重复性较差。门戈阳等[12]采用GC-MS法对醋酸发酵过程中的芳香族化合物组分进行了分析。结果表明:醋中芳香成分有19种，主要是醇和酸的结构成分，占全部芳香成分总含量的80%以上。通过气质联用仪测定得到的数据，手工固态发酵醋的香气成分达60种以上，而采用液态发酵的生产工艺香味种类只有前者的一半左右，通过醋精调配的食醋挥发性组分不超过22种，与阎玉林[13]的研究结果基本一致，这也说明采用固态发酵法酿造的酱油香气成分最丰富。

由表2可知，不同品牌的酱油挥发性组分所含有的有机酸、醇类、酯类、杂环类化合物只是品类不同及工艺不同导致含量出现变化，酿造酱油无论时间长短，微生物配比，典型的挥发性香气物质基本一致，而配制酱油的香气含量明显很低，而且苯环类防腐剂含量较高，这同黄毅[14]的研究结论一致。

表2 酱油的挥发性组分的含量Table 2 Content of volatile compounds in soy sauce

注：不同字母表示用Duncan检验法所得不同的显著性，P<0.05 (n=3)。

综上所述，通过对比前人的研究成果，本研究针对酱油、食醋的香气成分进行分析，确定了产品的品质，并总结了以下几个方面的内容：首先，依据HS-SPME-GC香气测定方式，检验12类酯类，效果明显，利用此方法进行香气测定，可以有效分辨产品质量的优劣。其次，采取气相色谱法针对酱油、食醋香气中主要成分进行测定，对萃取头种类、时间、温度等条件参数完成了优化，采取本方法的样品回收率高，效果明显。另外，也具体分析了生产工艺水平，希望能够对进一步加强与完善酱油和食醋生产工艺水平提供借鉴和帮助。