莱菔硫烷对常氧条件下成骨细胞活性的影响

陈巧凤 闻博 谢俊杰 曾冰

福建医科大学附属泉州第一医院骨科，福建 泉州 362000

莱菔硫烷(sulforaphane, SFN)是一种含硫化合物(异硫氰酸酯，ITC)，来自十字花科蔬菜，如西兰花和西兰花芽[1]，几项研究报道[2]指出，ITC具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化活性的作用。SFN的抗氧化功能是由增强核因子2(Nrf2)依赖性诱导的血红素加氧酶1(HO-1)介导的，保护细胞免受氧化应激的损伤[3-4]。SFN由于具有能够通过激活Nrf2信号传导途径诱导产生一定浓度的抗氧化酶的能力，已经受到了大量的关注，是Nrf2-ARE信号通路最有效的诱导剂之一[5]。

但是在2000年，即SFN出现后8年，Gamet等[6]第一次报道了SFN参与线粒体的变化。SFN似乎存在着相互矛盾的行为：SFN可以诱导癌细胞线粒体的有害变化，最终会通过细胞凋亡导致细胞死亡，但是它也可以保护非癌细胞线粒体免受氧化攻击，从而阻止了细胞死亡[7]，莱菔硫烷的这些作用与其调节线粒体活性变化有关。以往的文献都集中在SFN对氧化应激条件下细胞的作用，笔者将探索在常氧条件下SFN对成骨细胞的作用，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源：成骨细胞hfob1.19购于吉妮欧生物有限公司(中国)。

1.1.2 主要试剂及耗材：RPMI-1640(SH30809.01B/500 mL，Hyclone，美国); 胎牛血清(SV30087.03/500 mL，Hyclone，美国); 双抗(SV30010/100 mL，Hyclone，美国); 胰酶(SH30042.01/100 mL，Hyclone，美国); PBS(SN331，南京生兴生物技术有限公司，中国); DMSO(C6295-50 mL，Sigma，中国); 莱菔硫烷(SFN)(sbj-i0631/20 mg，南京森贝伽生物科技有限公司，中国); MTT(5 g，Bisharp，中国); PI-AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(EMS500FI/300 T，eBioscience，中国); 活性氧检测试剂盒(DCFH-DA, S0033，上海碧云天生物技术有限公司，中国)。

1.1.2 主要仪器和设备：CO2细胞孵育箱(Thermo公司，美国); 厌氧培养箱(Thermo公司，美国);多功能酶标仪(SpectraMax M5,MD公司，美国); 流式细胞仪(FACSCaliburBD Biosciences，美国); 高速离心机(Thermo公司，美国); 荧光分光光度计(上海棱光，中国)。

1.1.3 药液配制：莱菔硫烷(SFN)用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成100 mmol/L的储存液，分装后储存于-20 ℃。根据实验需要，使用时用1640完全培养液分别按照1∶20 000、1∶10 000、1∶5 000的比例稀释成最终浓度为5、10、20 μmol/L，直接加入到培养皿或培养板中。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：hfob1.19细胞是贴壁细胞，培养在含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的1640培养基中，置于34 ℃，含5% CO2的细胞培养箱中。当hfob1.19细胞长至80%～90%时，去除培养基，加入PBS冲洗1～2次。去除PBS后，加入1 mL胰酶消化1～3 min，加入3 mL完全培养基中和胰酶终止消化，将消化的细胞转移至15 mL离心管中，1 000 r/min, 离心5 min。倒掉上清后，加入3 mL培养基重悬细胞，1∶3传代至培养皿中培养。当hfob1.19细胞长至80%～90%时，去除培养基，加入PBS冲洗1～2次，去除PBS后，加入1 mL胰酶消化1～3 min，加入培养基重悬细胞，用血球计数板对细胞进行计数，六孔板每孔种2×106个细胞，将细胞摇晃均匀，放入培养箱中培养。常氧培养过夜后，根据实验分组分别加入SFN 0、5、10、20 μmol/L，分别培养24 h和48 h。

1.2.2 MTT检测细胞增殖：用血球计数板计5 000个细胞分别加入96孔板中。根据实验分组分别加入SFN 0、5、10、20 μmol/L，分别培养24 h和48 h 后，去掉培养基，每孔加入50 μL MTT，在细胞培养箱中继续培养约3 h。每孔加入150 μL DMSO，摇晃均匀，在570 nm处测定吸光度。

1.2.3 流式检测细胞凋亡：在六孔板中分别种2×106个细胞，根据实验分组分别加入SFN 0、5、10、20 μmol/L，分别培养24 h和48 h 后，用胰酶消化收集细胞。用预冷的PBS洗三次细胞，4 ℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入1 mL binding buffer洗细胞，4 ℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入100 μL binding buffer重悬细胞，加入5 μL PI和5 μL FITC-Annexin V，混合均匀，常温避光孵育15 min，加入400 μL binding buffer混匀，立刻用流式细胞仪检测。

1.2.4 检测细胞内ROS形成：hfob1.19细胞进行培养过夜后，根据实验分组分别加入SFN 0、5、10、20 μmol/L，分别培养24 h和48 h，常规消化细胞，收集细胞沉淀，制备细胞悬液。按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L。收集细胞后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为100万～2 000 万/mL，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，在荧光分光光度计检测荧光强度。

2 结果

2.1 MTT检测细胞增殖

图2 常氧条件下不同浓度SFN作用hfob1.19细胞24 h细胞流式细胞仪检测结果(与0 μmol/L SFN组相比，***P<0.001)Fig.2 Results of different concentrations of SFN on hfob1.19 cells for 24 h by flow cytometry

24 h组的OD值分别为0.63±0.02，0.77±0.04，0.91±0.04，0.85±0.01，而48 h组的OD值分别为0.53±0.04，0.65±0.04，0.82±0.02，0.76±0.04。结果表明，在常氧条件下，当SFN作用浓度为5 μmol/L 和10 μmol/L 时细胞的OD值增加明显，当浓度为20 μmol/L 时曲线趋于平缓甚至下降(图1)。实验至少独立重复3次，数据以均数±标准差表示。

图1 常氧下不同浓度SFN作用hfob1.19的OD值Fig.1 OD values of hfob1.19 cultivated under normoxia conditions with different concentrations of SFN addition

2.2 流式检测细胞凋亡

经流式细胞仪检测细胞凋亡后发现24 h组的细胞凋亡率分别为3.76%、3.71%、3.38%、3.33%，与0 μmol/L SFN组对比，10 μmol/L、20 μmol/L 组有统计学意义; 在常氧条件下SFN浓度为10 μmol/L、20 μmol/L时，细胞凋亡减少明显。与0 μmol/L SFN组对比，实验组之间有统计学意义(P<0.001)，见图2; 48 h组的细胞凋亡率分别为4.02%、3.49%，3.33%，3.09%，结果显示与0 μmol/L SFN组对比，各组均有统计学意义(P<0.001)，见图3; 在常氧条件下，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L SFN分别作用于成骨细胞时，细胞凋亡减少。实验至少独立重复3次，数据以均数±标准差表示。

2.3 检测细胞内ROS形成

24 h组的细胞ROS值分别为3 152.67±118.73，2 762.33±75.25，2 384.67±100.52， 2 165.67±196.02; 48 h组的细胞ROS值分别为3 762.33±74.65，3 291±90.02，2 956.67±78.27，2 746.33±82.08。结果显示，不同浓度的SFN会降低细胞内的活性氧水平，在浓度为10 μmol/L、20 μmol/L 时，降低更为明显。实验至少独立重复3次，数据以均数±标准差表示。见图4。

图3 常氧条件下不同浓度SFN作用hfob1.19细胞48 h细胞流式细胞仪检测结果(与0 μmol/L SFN组相比，***P<0.001)Fig.3 Results of different concentrations of SFN on hfob1.19 Cells for 48 h by flow cytometry

图4 常氧条件下不同浓度SFN作用成骨细胞24 h和48 h后hfob1.19细胞内活性氧水平(A：24 h组;B：48 h组。与0 μmol/L SFN组相比，**P<0.01，***P<0.001)Fig.4 The intracellular levels of reactive oxygen species of hfob1.19 cells were detected after different concentrations of SFN acted for 24 h and 48 h on normoxic conditions

3 讨论

氧化应激的概念最早源于人类对衰老的认识。1956年英国学者Harmna首次提出自由基衰老学说，该学说认为自由基(free radical)攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。缺血再灌注损伤是许多疾病(急性心肌梗塞，中风)或手术环境(移植，止血带相关手术)的常见并发症，其会产生氧化应激，有潜在的有害和致残后果。缺血再灌注在骨科各种临床操作中都能遇到，比如骨折愈合期间损伤血管的修复及新生血管的形成和生长，其产生的作用将影响成骨细胞的增殖和矿化。实验[8]表明，缺氧及缺氧再复氧环境会降低成骨细胞活性，增加细胞凋亡率，而且缺氧再复氧环境会加重缺氧状态下成骨细胞损伤。

目前对于成骨细胞缺氧的机制及治疗研究较多，莱菔硫烷在实验中也证实具有抗氧化还原的作用，在骨折愈合及骨质疏松的治疗中有作用，但其对常氧下成骨细胞作用未见报道。

莱菔硫烷的抗氧化作用主要是通过Nrf2-ARE 信号通路发挥重要作用。Nrf2 核转位并且结合核酸序列上的抗氧化反应元件ARE，活化 Nrf2-ARE信号通路并启动下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶系等的转录，从而减轻活性氧和亲电子物质引起的细胞损伤，使细胞处于稳定状态，维持机体氧化还原动态平衡[9]。莱菔硫烷的最大特点是其由于中心碳的亲电性而引起化学反应性的异硫氰酸酯基团，异硫氰酸酯基团与含硫、氮和氧的亲核试剂容易发生反应[10]。细胞中最常见的是异硫氰酸盐与蛋白质中的半胱氨酸残基和谷胱甘酸结合的可逆反应[11]，它可以诱导转录因子Nrf2转移到细胞核中，细胞核随后与抗氧化剂反应元件结合，导致抗氧化基因的转录，包括血红素加氧酶1，NAD(P)H醌氧化还原酶1，谷胱甘肽-S-转移酶和谷氨酸半胱氨酸连接酶[12]。莱菔硫烷是Ntf2途径的有效激活剂，可以调节许多抗氧化酶，防止氧化损伤。

线粒体是有氧细胞体内的能量发生器，为细胞提供大部分的ATP。当ATP充足时，体内需求/产生与电子传递链的最佳能力相结合。当体内处于低氧或者受到外部条件刺激时(比如氧化应激状态)，需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，包括：过氧化氢(H2O2)、氧自由基(02-)、羟自由基(0H-)等[14]。ROS产生增加，糖酵解和ROS形成之间存在正反馈[13]，消耗大量的ATP[15]。在生理条件下，ROS形成和抗氧化系统消除之间有一个平衡[16]，常氧培养下成骨细胞内的活性氧随时间变化不大，细胞凋亡比例也少。本实验发现在常氧培养条件下，不同浓度的莱菔硫烷均有降低体内活性氧，减少细胞凋亡的作用。但笔者认为在常氧条件下培养的成骨细胞产生的活性氧对机体影响并不大，常氧下莱菔硫烷的抗氧化还原临床意义不大。

在细胞增殖方面，SFN浓度为5 μmol/L、10 μmol/L 时可促进细胞的增殖，但当浓度提升到20 μmol/L，细胞增殖曲线趋于平缓甚至有所下降。考虑其原因，可能此时莱菔硫烷的应用改变了线粒体的结构和功能，影响了成骨细胞的活性。大量文献报道，莱菔硫烷通过参与线粒体复合物氧化损伤、细胞凋亡的线粒体途径、线粒体膜电位改变、线粒体生物合成以及内质网-线粒体紊乱等途径调控线粒体代谢。Sohel 等[17]在不同浓度的SFN诱导颗粒细胞(GC)中的抗氧化和凋亡作用的实验中发现SFN 浓度为2 μmol/L 和10 μmol/L 时没有观察到线粒体活性的变化；然而，在高浓度(20 μmol/L)下显著降低了线粒体的活性。低浓度的SFN激活与细胞存活途径相关的基因，而高浓度诱导参与抗增殖和凋亡途径的基因的表达。Zanichelli等[18]证明低浓度的SFN(0.25～5 μmol/L)促进了人类间充质干细胞的增殖并保护它们免于细胞凋亡和衰老，而较高浓度(20 μmol/L)具有细胞毒性作用，导致细胞进入细胞周期停滞，程序性细胞死亡和衰老。

因此，SFN是否在不同的细胞生存条件下发挥不同的药物作用，还是直接与细胞结合，发生代谢调控作用，这些都是未来进一步研究的热点，也将为临床在常氧条件下是否需要使用抗氧化剂及抗氧化剂使用剂量等提供参考。

4 结论

在常氧培养条件下，低浓度的莱菔硫烷可促进细胞的增殖，浓度升高反而会抑制细胞增殖；莱菔硫烷对成骨细胞可以起到抗氧化作用。