线粒体自噬在蛛网膜下腔出血中的研究进展

张永智，刘彬冰，田杨，史怀璋

线粒体自噬为一种保守的、线粒体特异性的自噬清除过程[1]。作为一种选择性的受损线粒体清除过程，其对于线粒体稳态及细胞存活的维持至关重要[2]。蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后72 h内的早期脑损伤（early brain injury，EBI）阶段，包括颅内压增高、灌注压减低、血脑屏障破坏、脑水肿及氧化应激等病变，以及迟发性脑血管痉挛阶段导致的脑缺血等病变均可以导致神经元能量供应异常、线粒体肿胀，继而释放活性氧（reactive oxygen species，ROS）及细胞色素C（cytochrome C，CytC）等物质进入细胞质，引起神经元的凋亡及坏死[3-5]。因此，作为维持线粒体稳态及清除受损线粒体的手段，线粒体自噬功能对于健康的维持及疾病的治疗至关重要。且脑神经元复杂的功能决定其需要更多的线粒体来提供能量，同时由于神经元为高度分化细胞，不能通过细胞分裂的方式清除细胞内的异常蛋白及受损细胞器，更增加了其对于线粒体活性及功能稳态的依赖[2，6]。所以在发生SAH的早期，如果适当诱导启动线粒体自噬、避免神经元死亡，将可能改善SAH患者的预后[1]。因此本文对线粒体自噬机制，SAH后线粒体形态变化对预后的影响，以及线粒体自噬在SAH中作用机制的研究进展进行了综述。

1 线粒体自噬

目前经典的线粒体自噬通路主要分为：①PINK1-Parkin介导的泛素依赖途径；②不依赖泛素的线粒体受体蛋白介导的线粒体自噬。

1.1 PINK1-Parkin介导的泛素依赖途径的线粒体自噬 在外界应激刺激下，线粒体膜电位减低，PINK1蛋白被持续转运至线粒体内膜的过程受阻，使得PINK1停留在线粒体外膜[7]。随后PINK1通过自身磷酸化的方式激活[8]，使得Parkin蛋白转位至线粒体外膜表面。Parkin为E3泛素连接酶，被PINK1磷酸化激活后可发挥正反馈机制，泛素化多种线粒体外膜蛋白，产生PINK1的底物——多聚泛素蛋白链。随着视神经诱变蛋白（optineurin，OPTN）和核点蛋白52（nuclear dot protein 52，NDP52）等多种蛋白聚集至受损线粒体外膜。OPTN、NDP52等诱导受损线粒体与自噬体膜蛋白-微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3，LC3）结合，激活了线粒体自噬[9]。在SAH大鼠模型中已证实了PINK1/Parkin的参与[10-11]，且动物实验证明PINK1/Parkin途径在脑组织中最活跃，内源性Parkin可减少中脑多巴胺能神经元的丢失[12]。研究表明在神经元中，去泛素化酶USP30具有对抗线粒体自噬的作用[13]，其通过抑制Parkin底物活性发挥作用，同时研究者还发现USP30缺乏可以减轻多巴胺神经元的氧化应激损伤。更值得注意的是，Wauer等[14]发现PINK1介导的泛素链磷酸化可以保护已被磷酸化的泛素链不受去泛素化酶的降解，从而放大线粒体自噬信号通路。

1.2 不依赖泛素的线粒体受体蛋白介导的线粒体自噬 线粒体受体蛋白参与线粒体自噬的一般特性为不依赖泛素化[1，15]，其与自噬体结合，靶向清除受损的线粒体。受体蛋白主要与LC3及A型γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）受体相关蛋白（GABA type A receptor-associated protein，GABARAP）的LC3相互作用区（LC3-interacting region，LIR）模体（motif）相结合，介导受损线粒体的清除[16]。参与线粒体自噬的线粒体受体蛋白主要包括NIP3样蛋白X（NIP3-liked protein X，NIX）、BCL-2相互作用蛋白3（BCL-2 interacting protein 3，BNIP3）及FUN14家族蛋白1（FUN14 domain-containing protein 1，FUNDC1）。NIX和BNIP3都拥有高度保守的LIR模体，在不同的应激刺激下，通过与LC3及GABARAP蛋白结合，参与线粒体自噬[17]。LIR模体的磷酸化，促进了NIX与LC3结合，介导线粒体清除。而BNIP3则通过释放视神经萎缩蛋白1（optic atrophy 1，OPA1），招募线粒体动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1），干扰线粒体动力，促进受损线粒体的分裂，进而加速了线粒体的清除[18-19]。

少数线粒体受体蛋白也同时参与了Parkin途径的线粒体自噬，如分布于线粒体内膜的抗增殖蛋白（prohibitins，PHBs）及心磷脂，在能量供应障碍引起的应激状态下，PHB2参与了Parkin途径的线粒体清除[20]。线粒体膜电位去极化、蛋白酶活性增加，使得线粒体外膜受损破裂，PHB2暴露于细胞质中，随后与LC3及自噬标志蛋白p62结合形成复合体。该复合体在受损线粒体处调节自噬体的产生，从而促进受损线粒体的清除[21]。但是在SAH后早期PHB2下降，说明SAH诱导线粒体自噬启动不够充分，当神经元遭受如氧化应激等严重损伤时，线粒体自噬作用不足以对抗损伤，最终神经元将不可避免地进入细胞死亡过程[10]。

2 线粒体形态与蛛网膜下腔出血

作为细胞内的高度动态化细胞器，线粒体通过融合（fusion）和分裂（fission）过程调节自身形态及能量产生，以适应细胞内外各种应激及能量供应异常等刺激。其中高度极化的神经元长树突和轴突的延伸特征对线粒体动力学更是提出了挑战：如何在一个神经元内有效地传输线粒体以能为远近端提供能量并调节其Ca2+水平[22]。线粒体在融合过程中，主要由线粒体融合蛋白1（mitofusion 1，MFN1）及2（MFN2）介导线粒体外膜的融合，而OPA1介导线粒体内膜的融合[22]。而线粒体分裂，作为线粒体自我更新及清除的手段，同时也是线粒体自噬中不可缺少的一步，主要由Drp1介导线粒体内膜和外膜的分裂[2，22]。Wu等[23]在SAH大鼠中应用Drp1蛋白的选择性抑制剂Mdivi-1，发现其可以减轻线粒体的过度分裂和线粒体嵴断裂，继而减轻细胞凋亡、氧化应激等损伤，改善SAH大鼠预后。

线粒体形态和线粒体自噬之间的关系体现在，如同线粒体膜电位减低一样，线粒体形态学改变将成为线粒体自噬的激活/抑制信号，将细胞状态与线粒体功能连接起来[22]。而线粒体融合与分裂二者之间并非是割裂对立的，目前研究发现，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）对Drp1及MFN2均有磷酸化激活作用[24-25]。作为细胞内能量感受器，AMPK被激活后，可以直接磷酸化激活unc-51样自噬活化激酶1（unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1），或抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的活性间接激活ULK1参与线粒体自噬[26-28]。Li等[29]在SAH大鼠及细胞内应用mTOR的抑制剂雷帕霉素，发现其可以减少Drp1活性形式的过度表达，减少线粒体的过度分裂，从而改善预后。Wu等[30]也发现Honokiol（和厚朴酚，一种去乙酰化酶Sirtuin-3的激动剂）可以通过AMPK依赖的方式，促进MFN1和MFN2的表达，促进线粒体融合，减轻SAH后早期脑损伤。

3 激活/抑制线粒体自噬对蛛网膜下腔出血的影响

在SAH后的早期，线粒体自噬通过清除受损线粒体而避免神经元的进一步死亡。但是当受损线粒体的数量过多、程度过重时，将超过线粒体自噬清除受损线粒体的能力，此时细胞凋亡及坏死将占据主导，同时伴随着自噬途径的关键蛋白失活，最终导致细胞死亡[31]。Zhang等[10]研究发现，在大鼠发生SAH后的早期，线粒体自噬及凋亡水平都出现了增高。根据线粒体产生ATP及ROS的多少，细胞内的变化可能不同：当ATP数量较多时，以线粒体自噬为主；当ATP缺乏、Ca2+增多及ROS产生时，将主要导致细胞的凋亡及坏死[32]。在SAH大鼠中应用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ或褪黑素后，线粒体自噬相关蛋白表达明显增多、凋亡减低，减少了退化神经元产生的同时，还改善了SAH大鼠短期及长期的神经功能预后[10-11]。反之，将参与线粒体自噬蛋白的抑制剂应用于SAH大鼠，将降低线粒体自噬通路相关基因的表达，导致线粒体自噬水平减低，神经元凋亡及坏死水平升高，血脑屏障通透性增加，SAH大鼠的脑水肿程度及神经功能障碍加重[10，33]。

在缺血性脑疾病研究中，认为在脑缺血的初始阶段以及在永久性脑缺血模型中，过度的自噬可诱导细胞死亡加重损伤，此时的自噬抑制剂具有神经保护作用[34-36]。而在目前的SAH研究中尚无此发现，一些学者认为与缺血性卒中的缺血再灌注损伤阶段一致，提高线粒体自噬水平将对神经元提供保护作用[37-38]。Palikaras等[1]认为最理想的治疗策略是同时激活线粒体自噬和生物合成，以减少线粒体数量的丢失及细胞死亡。

电压依赖阴离子通道蛋白1（voltagedependent anion channel 1，VDAC1）为线粒体外膜通道蛋白，介导Ca2+进出线粒体[39]。Li等[33]在SAH大鼠中发现VDAC1参与了线粒体自噬，VDAC1的表达在SAH后24～48 h到达顶峰，并诱导LC3 Ⅱ（LC3的活性形式）增多。与LC3的共定位、TUNEL染色、PI染色均证实VDAC1诱导的线粒体自噬在抑制细胞凋亡及坏死中发挥了作用。

总之，线粒体自噬作为神经元应对外界各种应激刺激下自我存活的一种应激保护性反应，在SAH发生后具有神经元保护作用。本文主要介绍了线粒体自噬的经典通路、在SAH中的作用机制及其对预后的影响。虽然目前仍未出现可以转化应用于临床SAH的线粒体自噬激活药物，但目前已经在临床上应用的部分药物（如二甲双胍等）已被证明对线粒体自噬具有调节作用。因此，在未来的SAH研究中，除了继续探索SAH中的线粒体自噬，更要尝试将其向临床转化，探寻促进线粒体自噬的药物，进而改善SAH患者的预后。

【点睛】本文介绍了线粒体自噬依赖/不依赖泛素的两种经典通路；线粒体形态改变（通过融合/分裂）可激活/抑制线粒体自噬从而调控细胞的存活或死亡；在SAH中通过促进线粒体自噬可改善患者预后。