指纹图谱与质谱分析竹叶化学成分

张飞虎, 于燕子, 张 胜, 李湘洲

(中南林业科技大学 材料科学与工程学院，长沙 410004)

0 引 言

指纹图谱分析是一种综合、定量，基于天然产物化学成分研究基础上的检测方法，一般采用高效液相色谱法结合分析软件进行，指纹图谱技术已广泛应用在中药生产过程控制中[1]，可以有效地解决生产中内在质量控制问题，保证中药制剂的药物作用。同时其也大量应用于不同来源物种的鉴别分析。指纹图谱常见的分析方法有非线性映射[2]、聚类分析[3]、相似性分析[4]、神经网络[5]和重叠率分析[6]等。

高效液相色谱-质谱联用是将高效液相色谱与质谱串联而成的仪器。高效液相色谱将样品中成分分离，质谱提供成分的相对分子量，从而获得化学成分的信息。高效液相色谱-质谱联用整合了高效液相色谱高分离和质谱高鉴别的特点，是天然活性成分研究的重要技术手段[7-8]，在实验教学中常与指纹图谱配合使用。

竹是一种重要的非木本森林资源，含有多种活性成分，竹叶提取物的低毒性和其广泛的药理活性，吸引了大量研究者的研究兴趣[9]。关于竹叶活性成分质量控制的两个主要方法：一种是用指纹图谱分析的方法，可提供样品完整的化学成分信息[10-11]；而另一种是基于特定的活性成分，对其进行分析研究[12-13]。如黄酮(荭草苷、异荭草素、牡荆素和异牡荆)[14]、酚酸(咖啡酸和绿原酸)[15]的含量。

本文将校园中常见6种竹的叶片进行高效液相指纹图谱分析所获得的数据进行了比较分析化学成分差异，让学生掌握指纹图谱分析在天然活性成分分析中的应用。对于有深入研究兴趣的同学，向他们展示运用高效液相色谱-质谱联用技术对具有地域特点的长沙青皮竹竹叶的具体成分进行鉴定，让学生了解高效液相色谱-质谱联用技术在天然活性成分研究中的应用。

1 实验方法

1.1 实验仪器与材料

指纹图谱分析的仪器为美国安捷伦公司生产的高效液相色谱仪(型号：Agilent1260)，配有紫外检测器与四元液相泵；用于液相-质谱分析的仪器为美国应用生物系统公司生产的高效液相色谱-质谱联用仪(型号：API QSTAR Pulsar)，配备四极杆/飞行时间串联质谱。实验用乙腈、甲醇为色谱纯，甲酸、磷酸为分析纯。实验用水为超纯水。

6种竹叶采自中南林业科技大学校园内，经中南林业科技大学林学院陈建华教授鉴定分别为长沙青皮竹(Bambusatextilisvar.persistens. B.M.Yang)；水竹(PhyllostachysheterocladaOliver)；假毛竹(Phyllostachyskwangsiensis)；琴丝竹(Phyllostachysaureosulcata)；斑竹(Phyllostachysbambusoidescv. Lacrima-Deae)；毛竹(Phyllostachysheterocyclacv. Pubescens)。上述竹叶样品依次编号为S1，S2，S3，S4，S5，S6。

1.2 样品的制备

竹叶收集后在阴凉处干燥，用植物粉碎机将竹叶粉碎成粗粉。分别称取粗粉2 g，加甲醇100 mL，回流提取2 h。将提取液浓缩至10 mL，然后用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取滤液进样。

1.3 指纹图谱分析条件

反相C18柱(长度与直径：250 mm×4.6 mm，填料粒度：5 μm)；流动相为0.1%磷酸(A)和乙腈(B)。洗脱条件：初始比例A相为88%，B相为12%；0～30 min之内A相由88%降低至84%，B相由12%升至16%；30～60 min之内A相由84%降低到75%，B相由16%升至25%；60～80 min之内A相由75%降低至40%，B相从25%升至60%。流速：1.0 mL/min，各样品的进样量为10 μL，检测波长330 nm。使用国家食品药品监督管理局发布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(版本号：2004A)对色谱图进行分析。

1.4 高效液相色谱-质谱条件

反相C18柱(长度与直径：100 mm×2 mm，填料粒度：5 μm)；流动相为0.1%甲酸(A)和乙腈(B)。洗脱条件：0 min：90%A，10%B；0～20 min，90%A→70%A，10%B→30%B；20～22 min：70%A→0，30%B→100%B；22～25 min：100%B。流速：0.20 mL/min, 各样品的注射量为10 μL。波长为330 nm。质谱分析条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式，毛细管电压3.5 kV，喷雾电压5 500 V，雾化气压力0.11 MPa，辅助气柱前压68 kPa，干燥温度450 ℃，干燥气体流速为8.0 L/min。

2 结果与讨论

2.1 指纹图谱相似性评价

6种竹叶的色谱图见图1，共有峰的相对面积和保留时间分别见表1和2，相似性分析结果见表3。

图1 6种竹叶的色谱图

由表1可知，6种竹叶色谱图中有8个共有峰。以最大峰面积的7号峰为对照，峰面积设为1，每个竹叶图谱中的其他共有峰与之相除得到相对峰面积。表2则提供了8个共有峰出峰的保留时间。由表内数据可知，每个竹叶色谱图中共有峰的保留时间的标准差(SD)均<1。说明这些峰的选取符合共有峰的特点。指纹谱图的相似性是一个量化的参数。该参数结合了色谱图中共有峰的重叠率和峰面积强度。每对样品色谱图之间的相似性体现了化学成分的差异性(见表3)。相似性范围在0～1之间，值为1时表示图谱是相同的，值为0则表示图谱完全不同。通过相似性评价系统计算了6种竹叶的色谱指纹图谱之间的相似性。长沙青皮竹的色谱图与水竹相似性最大，为0.992，说明两者化学成分很相似。长沙青皮竹和斑竹色谱图之间的相似性最小，为0.209，说明两者化学成分有很大的不同。

表1 共有峰的相对峰面积

表2 共有峰的保留时间 min

表3 竹叶指纹图谱的相似性分析

2.2 长沙青皮竹化学成分

长沙青皮竹样品通过高效液相色谱-质谱联用仪获得色谱的图见图2，质谱分析通过相对分子质量可鉴定出8个成分，见表4。成分多为黄酮类，符合竹叶化学成分的一般规律。

图2 长沙青皮竹叶液相色谱-质谱分析图

3 结 语

本实验通过指纹图谱分析对不同来源的6种竹类植物叶片化学成分的差异进行了比较，为竹叶的化学成分评价提供了一个新的视角。另外，通过高效液相色谱-质谱技术对具有地域特点的长沙青皮竹中的化学成分进行鉴定分析。

实验教学是林产化工专业培养的重要环节。竹叶指纹图谱分析实验课共8 学时， 其中4 学时进行高效液相色谱实验， 另外4 学时进行液相色谱-质谱联用仪的讲解和操作，指纹图谱的数据分析由学生在课后进行分析。该实验主要是色谱分析与质谱分析的应用，同时还涉及了数据统计分析的知识，综合性与实践性强， 可全面提升学生的科研能力和实验操作能力。