发酵香草兰豆荚主要风味成分及其前体物与蛋白的变化①

蔡莹莹 陈星星 谷风林 徐 飞

(1华中农业大学食品科学技术学院 湖北武汉 430070；2中国热带农业科学院香料饮料研究所 海南万宁 571533；3国家重要热带作物工程技术研究中心 海南万宁 571533；4海南省热带香料饮料作物工程技术研究中心 海南万宁 571533)

香草兰(Vanilla planifolia Andrews)又名香荚兰，原产于墨西哥，典型的热带兰科作物，被誉为“食品香料之王”[1]。它是食品、饮料和化妆品中最重要和最受欢迎的芳香植物之一[2-3]。香草兰的鲜豆荚没有特别的香味，但在经过杀青、发汗、干燥、陈化4个阶段的发酵，在陈化豆荚中会产生特有的香气。目前关于香草兰的发酵生香机理还不是很清楚，一般认为香草兰中的风味物质是在葡萄糖苷酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、果胶酶、纤维素酶等酶的作用下由风味前体物水解而形成[4]。此外，由于豆荚在发酵过程中一直与外界环境相接触，这就不可避免豆荚上有微生物的生长，而微生物的生长必然会产生大量的代谢产物，这些都影响到了风味物质的形成[5-6]。关于微生物可能参与发酵生香有大量报道，比如General等研究表明，从香草兰豆荚上分离到的由酵母分泌的糖苷酶能够将阿魏酸转化为香草酸等其他多种化合物[7]。因此内源酶和微生物对香草兰的发酵生香都起着很重要的作用。对于不同产地和品种的香草兰豆荚目前已经鉴定出460种以上的挥发性成分，主要包括芳香酯、醛类、酚类、酮类、脂肪酸等[8-10]，其中香兰素、香草酸、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸等物质含量较高，对香味的贡献也较大[11]。在课题组前期的研究中发现这些风味成分的前体物主要是L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、阿魏酸、葡萄糖、咖啡酸、肉桂酸、对香豆酸、松柏醇等[12]。此外鲜豆荚经过杀青之后其生命活力已经停止，细胞和组织结构受到破坏，蛋白在这个过程中可能发生了变化，并且蛋白也可能参与了酶促氧化和非酶氧化。

香草兰豆荚中的风味成分及其前体物在发酵过程中不断消耗和生成，但是对于主要风味物质在发酵过程中哪个阶段形成，以及在发酵过程中是如何进行累积的，还不是很清楚。因此，本文采用LC-MS/MS方法探究香草兰发酵过程中主要物质及其糖苷前体物的消长规律，并且采用电泳方法探究蛋白的变化，为完善生香加工技术，提高豆荚质量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材

不同发酵阶段的香草兰豆荚(鲜豆荚(FVB)，杀青豆荚(BVB)，发汗豆荚(SVB)，干燥豆荚(DVB)，陈化豆荚(CVB))由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供。

1.1.2 试剂

甲醇、乙腈、乙醇购自Merck公司，均为色谱纯。尿素、碘乙酰胺、硫脲、维生素C、十二烷基磺酸钠、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙硫酸(CHAPS)、二硫苏糖醇、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵购自Sigma(St．Louis， MO， USA)。 DNA提取酚试剂购自Solarbio，琼脂糖、24 cm IPG胶条(pH3-10)购自GE Healthcare(Uppsala，Sweden)。丙烯酰胺、交联聚乙烯吡咯烷酮、甲叉双丙烯酰胺购自Bio-Rad Labs(Richmond，CA，USA)。其余药品试剂：丙酮、硫酸铵、乙酸、蔗糖、硼砂、甘油、甲醇、磷酸、乙醇等购自北京化学试剂厂，均为分析纯。

1.1.3 仪器设备

研磨仪(MM 400，Retsch)， 超高效液相色谱(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A)，串联质谱(Applied Biosystems 6500 QTRAP)，高速冷冻离心机(Eppendorf centrifuge 5810R，德国)， 岛津紫外分光光度计(UV-2450，日本)， 恒温摇床(C25kc，美国)， 等电聚焦仪Ettan IPGphor 3(GE Healthcare)，垂直电泳仪Ettan DALTtwelve(GE Healthcare)，Image ScannerⅢ投射扫描仪(GE Healthcare)等。

1.2 方法

1.2.1 代谢物样品的提取和定量

(1)样品提取

不同发酵阶段的香草兰豆荚经真空冷冻干燥后利用研磨仪研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末状；然后分别称取100 mg的粉末，加入1.0 mL 70%的甲醇水溶液，4℃冰箱过夜，期间涡旋3次，提高提取率；最后将样品在4℃以10 000 g的转速，离心10 min分钟，吸取上清液，并用0.22 μm的微孔滤膜过滤后，用于LC-MS/MS分析。

(2)色谱质谱采集条件

a.液相条件主要包括：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm， 2.1 mm×100 mm；流动相：水相为超纯水(加入0.04%的乙酸)，有机相为乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脱梯度：0 min水/乙腈(95∶5 V/V)， 11.0 min为 5∶95 V/V， 12.0 min为 5∶95 V/V， 12.1 min为 95∶5 V/V， 15.0 min为95∶5 V/V；流速0.4 mL/min；柱温40℃；进样量 2 μL。

b.质谱条件主要包括：电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度500℃，质谱电压5 500 V， 帘气(curtain gas，CUR)25 psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation，CAD)参数设置为高。在三重四级杆中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞能(collision energy，CE)进行扫描检测，具体参数如表1。

表1 质谱检测参数[13]

(3)代谢物定性与定量

基于 MassBank， KNAPSAcK， HMDB， MoTo DB，METLIN和别的已经存在的代谢物信息公共数据库，根据二级谱信息进行物质定性，获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正[14]。

1.2.2 蛋白的提取和定量

参考Saravanan等[15]的方法进行蛋白的提取，并加以调整。称量2 g的香草兰豆荚粉末加入10 mL BPP蛋白提取液[2%2-巯基乙醇(V/V)、EDTA100 mmol/L， 30%蔗糖(m/V)、 Tris 10 mmol/L， 维生素 C 50 mmol/L、 硼砂 50 mmol/L、 1%Triton-100(V/V)、 1%PVPP(m/V)，pH 8.0]，在室温下涡旋混匀10 min后加入7 mL的DNA提取酚试剂，室温涡旋10 min，离心(4℃，15 000×g)15 min。将上层酚相转移至另一新的离心管中，加入等体积BPP蛋白提取液，室温涡旋5 min，离心(4℃，15 000×g)15 min。小心吸取上层清液与5倍体积预冷的过饱和硫酸铵甲醇溶液混匀后，-20℃沉淀6 h以上。悬浮液离心(4℃，15 000×g)15 min后，收集沉淀。沉淀用预冷的甲醇洗涤2次，随后用预冷的丙酮洗涤2次，室温干燥后溶解于蛋白裂解液(2 mol/L硫脲，7 mol/L尿素，13 mmol/L DTT，2%CHAPS)中，-20℃保存备用。蛋白质定量参考Bradford法[16]，用牛血清蛋白(BSA)作为标准品，在紫外分光光度计上进行蛋白浓度测定。

1.2.3 电泳

(1)SDS-PAGE电泳

二维凝胶电泳(1-DE)：主要采用不连续胶SDS-PAGE法[17]，用4%浓缩胶和12.5%分离胶进行电泳分离，蛋白上样量为30 μg，电泳参数设置为7 W/gel 2 h。

(2)双向电泳

二维凝胶电泳(2-DE)：第一向等电点聚焦在Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪上完成。使用24 cm的pH 3-10线性IPG干胶条，每根胶条上样量为1 500 mg蛋白，上样体积455 uL，常温水化18 h，每根胶条上覆盖5 mL矿物油防止样品挥发。聚焦程序设定为： 250 V， 3 h； 500 V， 2 h； 1 000 V， 1 h；8 000 V，3 h；8 000 V下进行110 000 Vhrs聚焦，每根胶条限流50 μA。第二向电泳前进行胶条平衡，将聚焦好的胶条放入平衡缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl， pH 8.8， 2%SDS， 30%甘油， 6 mol/L 尿素，0.02%溴酚蓝)中平衡，先后浸泡在1%DTT的胶条平衡液和含4%碘乙酰胺的胶条平衡液中，各15 min。平衡结束后，转移胶条垂直放于12.5%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的上端，用含有适量溴酚蓝的1%琼脂糖封住胶条，保证胶条与凝胶充分接触，在Ettan Daltsix电泳仪中进行电泳，电泳参数设置为5 W/gel 1 h， 7 W/gel 3.5 h。

(3)凝胶染色及图像采集分析

凝胶染色主要采用考马斯亮蓝(G-250)染色液进行染色[18]。脱色干净的凝胶采用Image ScannerⅢ扫描仪进行扫描。

1.2.4 数据分析

实验数据用Excel 2016进行均值计算及绘图。

2 结果与分析

2.1 不同发酵阶段的香草兰豆荚主要前体物与风味成分的动态变化

2.1.1 主要风味前体物的动态变化

(1)L-苯丙氨酸

如图1-A1所示，L-苯丙氨酸随着发酵的进行含量逐渐增加，发汗阶段达到顶峰，进一步发酵时含量降低，说明L-苯丙氨酸转化为风味成分可能主要在干燥和陈化阶段。酶对L-苯丙氨酸的转化为香兰素起着重要的作用。人们普遍认为香兰素是L-苯丙氨酸经过苯丙烷途径的产物，并且芳香环的4位羟基是通过细胞色素P450酶和肉桂酸羟化酶的作用而产生[19]。并且由于豆荚在发酵过程中一直与外界环境相接触，因此微生物可能参与了L-苯丙氨酸的转化，有研究表明几种白腐真菌和变形杆菌具有苯丙氨酸氨裂解酶活性，苯丙氨酸在苯丙氨酸氨裂解酶的作用下脱氨基成反式肉桂酸，进一步形成香兰素的前体如松柏醇，阿魏酸和松柏醛，最终形成香兰素[2]。

(2)L-酪氨酸

如图1-A2所示，L-酪氨酸在杀青阶段含量最高，可能是由于杀青时豆荚的细胞组织受到破坏，使得其他与酪氨酸以结合形式存在的物质发生了水解或转化，释放了酪氨酸，也可能来源于蛋白的降解。在发汗、干燥、陈化阶段含量逐渐降低，说明L-酪氨酸可能主要在发汗、干燥、陈化阶段参与风味成分的转化。由于豆荚在发酵过程中一直与外界环境相接触，也可能有多种微生物参与了L-酪氨酸的转化。

(3)阿魏酸

如图1-A3所示，阿魏酸在杀青阶段含量有所增加，可能是由于杀青时豆荚的组织结构被破坏，使得以结合形式存在于细胞壁的阿魏酸糖苷与酶接触，通过酶解作用释放游离的阿魏酸，使得阿魏酸的含量有所增加[20]。然而在发汗阶段阿魏酸的含量有所下降，说明阿魏酸转化为风味物质可能主要发生在发汗阶段。发汗使得杀青后的豆荚快速脱水干燥，避免后续发酵过程中霉菌的生长。此外，这个阶段提高处理温度，酶活性被激发，促进了风味前体物的水解[21]。Gallage等[22]研究表明，阿魏酸及其葡糖苷在香草醛合成酶(VpVAN)的作用下可以直接转化为香兰素及其葡糖苷。而在干燥和陈化阶段阿魏酸的的含量又逐渐升高，可能来自于别的物质的转化。

(4)葡萄糖

如图1-A4所示，从鲜豆荚到杀青豆荚葡萄糖的含量逐渐升高，在发汗阶段下降，可能是葡糖苷的水解未达到高峰期，并且已经水解的一部分葡萄糖作为底物被反应掉。而在干燥和陈化阶段葡萄糖的的含量又逐渐升高，可能是由于随着发酵的进行，葡糖苷的不断水解，风味成分和葡萄糖逐渐被释放出来[19]，葡萄糖的含量逐渐回升，陈化阶段达到最高。

(5)咖啡酸和肉桂酸

如图1-A5和1-A6所示，咖啡酸和肉桂酸在鲜豆荚到发汗豆荚中，随着发酵的进行，含量逐渐升高，在干燥阶段开始下降，陈化阶段进一步升高，说明咖啡酸和肉桂酸转化为风味物质可能主要在干燥阶段进行，并且二者之间的含量变化是相关的。Funk和Brodelius研究表明咖啡酸可以通过甲基化生成异-阿魏酸，随后生成3，4二甲基肉桂酸，该化合物进一步形成香兰酸，香兰素[23-25]。

图1 不同发酵阶段香草兰豆荚风味前体物的动态变化

(6)对香豆酸和松柏醇

如图1-A7和1-A8所示，从鲜豆荚到干燥阶段，随着发酵的进行，对香豆酸和松柏醇的含量逐渐降低，说明对香豆酸和松柏醇可能主要在前4个阶段参与反应。Podstolski研究表明，对香豆酸在非氧化性链缩短酶4HBS的作用下可以转化为4-羟基苯甲醛[5]。 陈化阶段有所回升，可能来源于别的物质的转化，如酪氨酸在苯丙氨酸解氨酶和酪氨酸氨裂解酶共同作用下可以形成对香豆酸[26]。阿魏酸也可以直接还原成松柏醇或去甲基化成咖啡酸[16]。木质素在木质素过氧化物酶和漆酶的作用下解聚为愈创木酚中间体，再进一步也转化为许多酚类化合物，如松柏醇、松柏醛、阿魏酸、香兰素、香草酸和对羟基肉桂醛等[19]。

2.1.2 主要风味成分的动态变化

(1)香草酸和香兰素

发酵过程中香草酸和香兰素的含量的变化如图2-B1和2-B2所示。由图可知随着发酵的进行，香草酸和香兰素的含量逐渐增加，在陈化豆荚中含量最高。这一点也和实际情况具有一致性，随着发酵的进行，香气逐渐变得浓郁，说明主要的风味物质的种类和含量都得到进一步的增强，并且和其他阶段相比，陈化为发酵的最后一步，历时半年以上，这期间豆荚会发生多种化学反应和生化反应，如酯化、醚化、氧化等反应，形成香草兰特有香气[27]。从图中也可以看出，香草酸主要在陈化阶段产生，然而香兰素主要产生于发汗阶段。香兰素在发汗之后增加缓慢，可能是因为一部分香兰素参与了不同的化学或酶促反应，而这些反应也可能会形成香气化合物，这对于确定香草兰的最终质量至关重要[28-30]，而且Havkin-Frenkel等研究也表明，干燥和陈化会导致香兰素和其他风味物质的损失[31]。另外与香气形成没有直接关系的其他反应也可以解释香兰素的这些损失，例如升华，与水共蒸发[30]，或与豆荚中的木质素形成共价键[29]。因此，香兰素的实际产量高于我们所检测到的含量。

(2)对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛

发酵过程中对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛的含量的变化如图2B3和B4所示，由图可知随着发酵的进行，对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛都是在发汗阶段含量最低，在干燥和陈化阶段逐渐升高。这一点和浦帆等的研究结果具有一致性[32]。研究表明陈化豆荚中对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛浓度分别为100 mg/kg干重和1 g/kg干重[11]。在现代分析技术的支持下，在鲜豆荚中发现了对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛的糖苷[22，33]。因此，对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛可能来自于其葡萄糖苷的水解，并且这种水解反应可能主要在干燥阶段和陈化阶段发生。

图2 不同发酵阶段香草兰豆荚主要风味成分的动态变化

2.2 蛋白的动态变化

如图3所示，SDS-PAGE分析结果表明：不同发酵阶段的香草兰蛋白有很大的差异，并且随着发酵的进行蛋白逐渐减少。其中鲜豆荚的蛋白分布范围比较宽，蛋白主要集中在26～90 kD。和鲜豆荚相比，杀青豆荚的蛋白有所减少，其中小于19 kD的蛋白消失。和鲜豆荚相比，发汗豆荚，干燥豆荚，陈化豆荚的蛋白变化非常明显，蛋白数量明显减少，分子量集中表现在19～35 kD和蛋白条带上部，说明随着发酵的进行，蛋白可能发生了部分降解和一些交联。Hansen等[34]研究表明，在酪蛋白酸钠或乳清蛋白浓缩物存在下香兰素的风味强度会降低，作者猜测这种降低可能是由于半胱氨酸-醛缩合或希夫碱形成。Pkw等[35]研究表明增加香兰素和蚕豆蛋白质胶束(PMM)的浓度可以增加蛋白质与香兰素结合的百分比，热处理(变性)PMM的结合能力高于未处理(天然)PMM的结合能力。而随着发酵的进行香兰素的含量是逐渐升高的，因此蛋白可能发生了降解或则交联。在发汗和干燥阶段在35 kD左右和19 kD左右的蛋白条带颜色逐渐加深，说明此区间内亚基种类增多，所占比例增大。但是在陈化阶段，和发汗和干燥阶段相比，35 KD左右和19 KD左右的蛋白条带颜色变浅，可能是由于陈化生香期间蛋白发生了降解。从3-DE图谱中可以看出随着发酵的进行，蛋白的数量变少了，这和SDS-PAGE电泳图的结果具有一致性。

3 讨论与结论

图3 不同发酵阶段香草兰豆荚蛋白的SDS-PAGE电泳图和双向电泳图

通过LC-MS/MS方法探究了不同发酵阶段的香草兰豆荚主要风味前体物L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、阿魏酸、葡萄糖、咖啡酸、肉桂酸、对香豆酸、松柏醇的消长规律和主要风味物质香草酸、香兰素、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的消长规律。对于主要风味前体物而言，L-苯丙氨酸的含量在发汗阶段最高。而L-酪氨酸的含量在发汗、干燥、陈化阶段逐渐降低。阿魏酸和葡萄糖的含量从鲜豆荚到杀青豆荚呈现上升趋势，发汗阶段下降，干燥和陈化阶段又逐渐升高。咖啡酸和肉桂酸的含量在鲜豆荚到发汗阶段呈现上升趋势，在干燥阶段开始下降，陈化阶段开始回升。对香豆酸和松柏醇从鲜豆荚到干燥阶段的含量呈现下降趋势，陈化阶段开始回升；对于主要风味物质而言，香草酸和香兰素的含量从杀青阶段到陈化阶段逐渐增加。在发汗阶段对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛的含量最低，在干燥和陈化阶段逐渐升高。此外还探究了不同发酵阶段的香草兰豆荚蛋白的动态变化，电泳图表明随着发酵的进行蛋白条带逐渐减少，并且鲜豆荚和杀青豆荚的蛋白分布范围比较宽，陈化豆荚的蛋白分布范围比较集中。本文主要探究了主要风味成分及其前体物的消长规律，而对于在发酵过程中风味前体物与风味前体物之间，风味成分与风味成分之间，前体物与风味成分之间的相互转化，可能是通过内源酶或与豆荚互作的微生物进行作用的。