CD8+T细胞PD-1基因CRISPR/Cas9编辑体系电穿孔条件的优化

王淑敏，张代群，李 峰，张 毅

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院肿瘤中心 郑州 450052 3)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 4)河南省肿瘤免疫与生物治疗重点实验室 郑州 450052

目前，免疫治疗已经成为最具前景的肿瘤治疗手段之一，T细胞在肿瘤免疫治疗中起到关键作用。然而，在实体瘤肿瘤微环境中存在多种免疫逃逸机制，可以识别T细胞表面的免疫检查点，使T细胞不能对肿瘤细胞进行有效的识别和杀伤，并且走向耗竭状态[1]，抑制免疫检查点可以刺激或增强抗肿瘤免疫应答[2]。PD-1存在于活化的T细胞和调节性T细胞(Treg)上，其配体PD-L1可在肿瘤细胞和树突状细胞[3-5]上表达。肿瘤细胞表面的PD-L1分子与T细胞表面的PD-1结合，可以抑制T细胞的免疫活性；阻断两者的结合，可恢复T细胞的抗肿瘤作用。成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)已经成为时下最流行的可以在多种物种中进行基因编辑的工具[6]。相比于传统重组锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)和转录激活因子样效应蛋白核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)等技术，CRISPR/Cas9技术具有操作简单、效率高、成本低的优点[7]。利用CRISPR/Cas9对人原代T细胞进行基因编辑，为基于T细胞的免疫治疗提供了巨大的应用前景[8]，但CRISPR/Cas9编辑体系会对细胞活性造成一定损害。目前最普遍应用的是Lonza公司的4D-Nuleofector仪器，其配有不同的电转缓冲液和脉冲组合，可针对各种类型的细胞进行电穿孔[9]。本文根据文献报道和前期研究[9-10]，设计两种电转缓冲液和脉冲组合方案，检测两种方案编辑CD8+T细胞PD-1基因的效率，比较两种方案对T细胞生物学特性的影响，旨在筛选出一种更适合T细胞基因编辑的电穿孔条件。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂胎牛血清、高糖DMEM培养基、RPMI 1640培养基均购自美国Sigma公司，人外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司，CD3单抗、CD28单抗、高保真DNA 聚合酶、Lipofectamine 3000转染试剂、Cas9核酸酶购自美国Thermo Fisher Scientific公司，T7核酸内切酶1(T7E1)和BbsⅠ酶购自美国NEB公司，流式荧光抗体均购自美国Biolegend公司，重组人IL-2购自北京双鹭药业股份有限公司，T7体外转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，蛋白酶K、质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，RNA纯化试剂盒购自美国Zyom Research公司，T4 DNA连接酶、Stabl3感受态细胞、Premix Taq、基因组DNA提取试剂盒和Primer STAR聚合酶均购自日本TaKaRa公司，DNA纯化试剂盒购自美国Axygen公司，电转仪和电转缓冲液均购自瑞士Lonza公司，质粒pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)购自美国Addgene公司，人胚肾293T细胞购自中国科学院细胞所。

1.2PD-1sgRNA序列及引物的设计与合成使用在线工具http://crispr.mit.edu/设计3条PD-1 sgRNA序列，使用NCBI网站的Primer-blast在线设计3条PD-1 T7E1检测引物及PD-1 vitro上下游引物、PX458 check检测引物。PD-1 T7E1检测引物设计在编辑位点的上游150～200 bp和下游350～400 bp处(反之亦可)。所有序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成，见表1。

表1 sgRNA及引物序列

1.3靶向PD-1重组PX458质粒的构建按图1模式构建质粒。用BbsⅠ酶线性化PX458质粒，并使用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物，检测浓度。将合成好的sgRNA单链混合并稀释至1 mol/L，退火形成双链，按照sgRNA∶线性PX458质粒物质的量比为5∶1混合，然后加入1 μL T4 Ligation buffer、1 μL T4 DNA连接酶，终体积为10 μL，16 ℃连接过夜。将连接产物转化Stabl3感受态细胞，涂布于带有氨苄青霉素的平板，挑取单个克隆至含有LB肉汤培养基和氨苄青霉素的2 mL离心管中，在37 ℃、250 r/min水平摇床中培养2～3 h，然后做菌液PCR。PCR体系：1.5 μL菌液，1.0 μL PX458 check上游引物，1.0 μL PD-1 sgRNA下游引物，10.0 μL Premix Taq，无菌水6.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保持。将PCR产物进行凝胶电泳，选择能扩增出单一且明亮条带的菌液，转移至摇菌管中，37 ℃摇床中220 r/min过夜，抽提质粒，送上海生工生物工程有限公司测序验证。

图1 重组质粒示意图

1.4293T细胞培养与转染将处于对数生长期的293T细胞以4×105个/孔的密度接种到6孔板，在含高糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)、体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养24 h，待细胞融合度达到70%左右开始转染。转染前2 h更换为无血清培养基对细胞进行“饥饿”处理，用Lipofectamine 3000将1.3中构建好的重组质粒转入293T细胞中，以空PX458质粒为阴性对照。

1.5PD-1切割效率的检测转染48 h后，消化293T细胞，用PBS洗3次，按照试剂盒说明书操作提取基因组DNA，使用Primer STAR聚合酶和PD-1 T7E1检测引物进行PCR，扩增编辑位点的DNA片段。以纯化后的PCR产物为模板行PCR。反应体系：DNA片段200 ng，10×NE Buffer 2 μL，无核酸酶水补充至19 μL，行PCR。反应条件：95 ℃ 5 min，95～85 ℃(按2 ℃/s梯度程序降温至85 ℃)，85～25 ℃(按0.1 ℃/s梯度程序降温至25 ℃)。然后加入1 μL T7E1酶切15 min，立即行20 g/L的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪拍照观察。若靶点被CRISPR/Cas9成功编辑，经PD-1 T7E1酶切，电泳结果会呈现3条带，大小分别约为600、400和200 bp。用Image J软件对条带进行灰度分析，计算切割效率。切割效率=(200 bp条带灰度值+400 bp条带灰度值)/3条条带灰度值总和×100%。

1.6sgRNA的体外转录及活性验证以插入PD-1 sgRNA2的重组PX458质粒为模板，加入PD-1 vitro上、下游引物，PCR扩增出体外转录模板，用DNA纯化试剂盒纯化。参照说明书，用T7E1体外转录试剂盒将模板转录成RNA，用RNA纯化试剂盒对sgRNA进行纯化，于-80 ℃保存。

以293T细胞基因组为模板，用T7E1检测引物进行PCR和凝胶电泳，回收产物并纯化，以产物为模板行PCR。扩增体系19 μL，包括10×Cas9 Buffer 2 μL体外转录的2 μmol/L sgRNA 2 μL，1 μmol/L的Cas9 2 μL，适量去核酸酶水，室温孵育10 min，模板DNA0.2 pmol，37 ℃孵育30 min之后再加入1 μL蛋白酶K，37 ℃反应15 min，进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪拍照，用Image J软件对条带进行灰度分析。以切割效率反映sgRNA活性，计算方法同1.5。

1.7CD8+T细胞电穿孔条件外周血单个核细胞的分离、CD8+T细胞的分选、培养和活化见参考文献[11]。收集活化后的CD8+T细胞，离心弃上清。将3 μg sgRNA和3 μg Cas9室温(25 ℃)共孵育10min，用电转染缓冲液稀释，用此稀释液重悬CD8+T细胞至3×104个/μL，转移到100 μL的电转杯中，在Lonza 4D-Nuleofector仪器中分别用方案一(P2电转染缓冲液+EH100脉冲)、方案二(P3电转染缓冲液+EO115脉冲)进行电穿孔。以只加Cas9未加sgRNA的细胞为对照。所用的电转染缓冲液均为Lonza公司原厂包装，脉冲均为Lonza 4D-Nuleofector仪器内置程序。电穿孔后的细胞用37 ℃预热的含有300 IU/mL IL-2、体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于24孔培养板中在体积分数5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。

1.8电穿孔后CD8+T细胞活性及PD-1敲除效率、分化状态和增殖能力的检测以未电穿孔的细胞为对照组，分别用1.8项两种方案(方案一组、方案二组)对活化3 d的CD8+T细胞进行电穿孔，以敲除PD-1。①继续培养48 h后收取细胞，加入7AAD-PerCP流式抗体，检测细胞活性。②电穿孔后的细胞培养3 d后，再次加入CD3单抗、CD28单抗刺激6 h，加入抗人CD8-APC-Cy7、PD-1-FITC、7AAD-PerCP流式抗体，在4 ℃条件下避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。PD-1敲除效率=(对照组PD-1表达量-实验组PD-1表达量)/对照组PD-1表达量×100%。③分别取3组CD8+T细胞1×105个/管，加入CD8-APC-Cy7、CD45RO-APC、CCR7-PE，4 ℃避光孵育15 min后，上流式细胞仪检测。CD45RO-CCR7+为初始T细胞(Tn)，CD45RO+CCR7+为中心记忆性T细胞(Tcm)，CD45RO-CCR7-为效应T细胞(Teff)，CD45RO+CCR7-为效应记忆性T细胞(Tem)。④分别将3组CD8+T细胞按照5×106个/孔铺于12孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。第2、4、6和8天收取细胞，混匀后吸取10 μL于血球计数板计数，计算增殖倍数。增殖倍数=终细胞数/初始细胞数。

1.9统计学处理采用SPSS 21.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验分析3组CD8+T细胞活性、细胞增殖倍数的差异，应用t检验比较两种方案PD-1敲除效率的差异，检验水准α=0.05 。

2 结果

2.1靶向PD-1的PX458重组质粒测序结果及PD-1抑制效率测序结果见图2。T7E1核酸内切酶法验证果见图3。由图3可知，sgRNA1、2、3介导的PD-1基因切割效率分别为60.32%、68.61%、40.96%，其中PD-1 sgRNA2切割效率最高。体外转录sgRNA2对293T细胞PD-1基因的切割效率达93%(图4)。

2.2方案一、二组PD-1敲除效率的比较结果见图5。方案一组敲除效率[(87.70±1.03)%]明显高于方案二组[(70.13±2.13)%](t=7.440，P=0.002)。

上、中、下：PD-1-sgRNA1-PX548、PD-1-sgRNA2-PX548和PD-1-sgRNA3-PX548测序结果

图2测序结果

M：Marker；0：阴性对照；1、2、3：PD-1 sgRNA1、2、3

M：Marker；0：阴性对照；1：PD-1 sgRNA2

A：方案一对照组；B：方案一实验组；C：方案二对照组；D：方案二实验组

2.3电穿孔后CD8+T细胞活性结果见图6。对照组[(1.07±0.15)%]、方案一组[(1.24±0.13)%]和方案二组[(1.56±0.28)%]死细胞比例差异无统计学意义(F=4.657，P=0.060)。

A：对照组；B：方案一组；C：方案二组

2.43组CD8+T细胞分化状态的比较见图7、表2。3组CD8+T细胞的分化状态差异无统计学意义。

A：对照组；B：方案一组；C：方案二组

表2 3组CD8+T细胞分化状态的比较(n=3) %

2.53组CD8+T细胞增殖倍数的比较见表3。由表3可知，3组细胞增殖倍数差异无统计学意义。

表3 3组CD8+T细胞增殖倍数的比较(n=3)

3 讨论

T细胞可以通过抗原提呈细胞特异性识别肿瘤细胞表面抗原，并有效地杀伤肿瘤细胞，然而，肿瘤微环境中存在复杂的机制，使抗肿瘤免疫反应延迟、改变甚至停止[12]，即“免疫逃逸机制”。免疫逃逸导致自身免疫系统不能有效识别并杀伤肿瘤细胞，导致肿瘤生长失去控制而处于异常过度增殖状态[13]。通过抑制这些免疫检查点来解除患者免疫抑制状态，增强抗肿瘤免疫反应，目前被认为是最有前景的肿瘤治疗方法之一。

已有文献[14-17]报道使用Cas9蛋白和体外转录或合成的sgRNA形成的复合物进行电穿孔可以有效地对人原代T细胞进行基因编辑。CRISPR/Cas9作为一种基因编辑技术，目前被广泛应用，该技术具有许多明显的优势：没有物种限制；基因编辑方式多样(敲除、插入[18]、抑制、激活等)；可实现对多个靶基因同时编辑；操作较简单，且编辑效率高[12]。利用该技术对T细胞进行基因编辑，如敲除一个或多个免疫检查点，之后进行过继回输，可以减少免疫抑制的发生，增强T细胞的抗肿瘤免疫反应[8]。然而向T细胞中递送CRISPR/Cas9系统的方法有很多种，但基因编辑效率及基因编辑后对T细胞活性的影响还有待优化。因此本研究采用Lonza公司的4D-Nuleofector仪器递送靶向T细胞PD-1的CRISPR/Cas9蛋白，根据已有文献报道和本实验室前期实验，选择两种该仪器配有的电转染缓冲液和脉冲组合进行对比，即方案一(P2电转染缓冲液 + EH100脉冲)与方案二(P3电转染缓冲液 + EO115脉冲)，通过检测细胞上PD-1基因编辑效率及编辑后细胞活性、分化与增殖，鉴定出P2电转染缓冲液和EH100脉冲的组合是一种更加高效的电穿孔条件，可以有效地提高T细胞基因编辑效率并且不会影响T细胞的活性、分化和增殖。