上调PHLPP1表达对食管癌细胞增殖、黏附、侵袭和迁移能力的影响

刘一博, 张西亮, 刘 涵, 杜芮娴

1)新乡医学院临床医学系 河南新乡 453000 2)商丘市第一人民医院消化内科 河南商丘 476000 3)商丘市第一人民医院全科医学科 河南商丘 476000

食管癌的发生与多种基因的调控有关。PHLPP1是美国加州大学圣地亚哥分校医学院药理学的科研人员发现的，其在人类细胞膜、细胞质、细胞核上均有表达，在人体内不同组织中的表达程度不同，调控细胞的增殖过程[1-2]，参与肿瘤、心力衰竭等疾病的发生[3-4]。目前在肺癌、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤中发现PHLPP1表达下调甚至缺失，推测其可以抑制肿瘤细胞的生长和转移[5-7]。有研究[8]发现上调PHLPP1的表达可以抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。本实验检测PHLPP1在食管癌细胞和正常食管上皮细胞中的表达水平，探讨上调PHLPP1表达对食管癌细胞增殖、侵袭等生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂人食管癌细胞Eca109、EC9706、KYSE510和人正常食管上皮细胞HEEC均购自美国ATCC细胞库，用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养。PHLPP1抗体购自英国Biorbyt公司；过表达PHLPP1的重组慢病毒和阴性对照慢病毒均购自北京百奥川生物科技有限责任公司；基质金属蛋白酶(MMP)1抗体、神经性钙黏附素(N-cadherin)抗体、上皮性钙黏附素(E-cadherin)抗体购自美国Santa Cruz公司；MMP9抗体、增殖细胞核抗原(PCNA)抗体购自美国Proteintech公司。qRT-PCR和反转录试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2qRT-PCR检测食管癌细胞中PHLPP1mRNA的表达取Eca109、EC9706、KYSE510和HEEC，PBS洗涤。Trizol提取细胞总RNA。反转录反应体系为：2 μL总RNA、1.2 μL反转录引物、0.2 μL的MMLV反转录酶，添加RNase Free ddH2O至20 μL。反转录条件为：42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min。PCR反应体系为：10 μL的2×定量PCR Master Mix、0.08 μL上、下游引物(20 μmol/L)、2 μL的cDNA模板、0.4 μL的Taq DNA聚合酶，加ddH2O至20 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min ，1个循环；95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，40个循环。引物序列如下：GAPDH上游：5’-CAGAACATCATCCCTGCCTC TAC-3’， 下游：5’-TTGAAGTCAGAGGAGACCAC CTG-3’。 PHLPP1上游：5’-AAGCCAGACTTACTA CATTTGC-3’，下游5’-TCATTGAAAGAAAGACCCA GA-3’。按照2-ΔΔCt法计算PHLPP1 mRNA的表达。

1.3Western blot检测食管癌细胞中PHLPP1蛋白的表达收集Eca109、EC9706、KYSE510和HEEC，用冰预冷的PBS洗涤，添加细胞裂解液，吹打混匀，4 ℃高速离心，吸取上清，经BCA法定量以后，取适量的总蛋白加入到5×SDS上样缓冲液中煮沸变性。以100 g/L的分离胶和50 g/L的浓缩胶进行电泳，每孔上样30 μg蛋白样品。把凝胶放在转移缓冲液中平衡10 min，NC膜裁剪成与凝胶大小相同之后放入转移缓冲液中浸泡25 min，以100 V的电压转膜。转膜结束后，将NC膜放在50 g/L脱脂奶粉中孵育90 min，再将膜浸泡至PHLPP1抗体(1∶800稀释)中室温反应90 min，加二抗(1∶3 000稀释)室温反应2 h后，用ECL发光，以Image J分析。以PHLPP1与GAPDH(内参)条带灰度值的比值作为PHLPP1蛋白的相对表达水平。

1.4上调PHLPP1对Eca109细胞生物学行为的影响

1.4.1 实验分组 取Eca109细胞，常规方法种植到6孔板内，当细胞汇合度达40%时进行慢病毒感染，感染复数为30，在细胞中添加10 mg/L polybrene以提高转导效率。感染24 h后更换新鲜的细胞培养液继续培养3 d，嘌呤霉素筛选5 d。以稳定感染过表达PHLPP1重组慢病毒的Eca109细胞为Lv-PHLPP1组，以稳定感染阴性对照慢病毒的Eca109细胞为Lv-NC组，以未行慢病毒感染的Eca109细胞为对照组。用qRT-PCR和Western blot检测3组细胞中PHLPP1表达情况，实验重复3次。

1.4.2 MTT检测细胞增殖和黏附情况 细胞增殖：将3组细胞接种到96孔板中，每组3孔，每孔3×103个细胞。培养24 h后，添加MTT溶液(每孔添加20 μL)孵育4 h，然后添加DMSO，检测492 nm的A值，计算细胞存活率。细胞存活率=Lv组或Lv-PHLPP1组A值/对照组A值×100%。实验重复3次。

细胞黏附：96孔板中添加纤维连接蛋白，置于超净工作台中风干以后，每孔添加20 g/L牛血清白蛋白37 ℃孵育1 h，PBS洗涤。将3组细胞接种到96孔板中，每组3孔，孵育120 min，用PBS洗掉未黏附的细胞。按照上述MTT方法检测492 nm的A值，计算细胞黏附率。细胞黏附率=Lv组或Lv-PHLPP1组A值/对照组A值×100%。实验重复3次。

1.4.3 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移 用基质胶包被Transwell小室，37 ℃孵育3 h，添加不含血清的培养液继续孵育40 min。在Transwell小室的上室中分别添加3组细胞悬液各200 μL(以不含血清的培养液配制，细胞浓度为5×105个/mL)，下室中加入500 μL含有血清的培养液。24 h后，取出Transwell小室，用棉签擦掉没有穿膜的细胞，用PBS洗2次，多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下选5个视野观察，记录侵袭细胞数。细胞迁移实验前不用基质胶湿化，其余同侵袭实验。实验重复3次。

1.4.4 Western blot检测细胞中PCNA、MMP1、MMP9、N-cadherin、E-cadherin蛋白水平 取3组细胞，用Western blot法检测细胞中PCNA(抗体以1∶1 000稀释)、MMP1(抗体以1∶600稀释)、MMP9(抗体以1∶600稀释)、N-cadherin(抗体以1∶600稀释)、E-cadherin(抗体以1∶600稀释)蛋白水平，步骤同1.3。实验重复3次。

1.5统计学处理采用SPSS 21.0分析。各组PHLPP1 mRNA和蛋白、存活率、黏附率、侵袭细胞数、迁移细胞数以及PCNA、MMP1、MMP9、N-cadherin、E-cadherin蛋白水平的比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1PHLPP1在食管癌细胞和正常食管上皮细胞中的表达见图1和表1。人食管癌细胞Eca109、EC9706、KYSE510中PHLPP1 mRNA和蛋白水平均低于人正常食管上皮细胞HEEC，且Eca109中表达最低。选用Eca109细胞进行后续实验。

1～4：分别为HEEC、EC9706、KYSE510和Eca109

细胞PHLPP1 mRNAPHLPP1蛋白HEEC41.25±0.780.86±0.09EC970625.16±2.79∗0.45±0.02∗KYSE51012.38±1.36∗#0.23±0.04∗#Eca1095.36±0.58∗#△0.04±0.03∗#△F313.286135.455P<0.001<0.001

*：与HEEC比较，P<0.05；#：与EC9706比较，P<0.05；△：与KYSE510比较，P<0.05

2.23组细胞中PHLPP1表达的比较见图2和表2。Lv-PHLPP1组细胞中PHLPP1 mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组和Lv-NC组，提示高表达PHLPP1的食管癌细胞株构建成功。

1～3：分别为对照组、Lv-NC组、Lv-PHLPP1组

组别PHLPP1 mRNAPHLPP1蛋白对照组5.32±0.060.11±0.03Lv-NC组5.37±0.080.13±0.06Lv-PHLPP1组14.31±1.26∗0.34±0.03∗F126.00427.056P<0.001<0.001

*：与对照组和Lv-NC组比较，P<0.05

2.33组细胞增殖、黏附、侵袭和迁移能力比较结果见表3。Lv-PHLPP1组细胞存活率、黏附率、侵袭细胞数和迁移细胞数均降低。

表3 3组细胞存活率、黏附率、侵袭细胞数和迁移细胞数的比较(n=3)

*：与对照组和Lv-NC组比较，P<0.05

2.43组细胞中PCNA、MMP1、MMP9、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达的比较结果见图3和表4。Lv-PHLPP1组细胞中PCNA、MMP1、MMP9、N-cadherin蛋白表达均降低，E-cadherin蛋白表达升高。

1～3：分别为对照组、Lv-NC组、Lv-PHLPP1组

组别PCNAMMP1MMP9N-cadherinE-cadherin对照组0.35±0.050.71±0.060.78±0.080.86±0.070.65±0.07Lv-NC组0.33±0.060.73±0.090.76±0.060.89±0.090.63±0.08Lv-PHLPP1组0.18±0.03∗0.26±0.04∗0.29±0.05∗0.53±0.06∗0.95±0.09∗F11.10047.79755.36821.63314.907P0.010<0.001<0.0010.0020.005

*：与对照组和Lv-NC组比较，P<0.05

3 讨论

PHLPP是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白酶家族，该蛋白家族在肿瘤中发挥抑制作用，有两个亚型，其中PHLPP1基因位于18q21.33染色体上，具有高度保守性，其编码的蛋白质可以将核糖体蛋白S6激酶、蛋白激酶C等蛋白酶去磷酸化，从而调控这些蛋白酶的活性，影响细胞的多种生理和病理功能[9]。PHLPP1在乳腺、前列腺、咽喉等多种组织中均有不同程度的表达[10]。近年来的研究[11]显示，PHLPP1可以作为一种肿瘤抑制基因阻碍肿瘤的发展。在下咽鳞状细胞癌、白血病细胞中的研究[12-13]显示，PHLPP1过表达可以降低肿瘤细胞的增殖能力。本实验的结果表明，PHLPP1在食管癌细胞Eca109、EC9706、KYSE510中的表达水平均低于人正常食管上皮细胞HEEC，并且上调PHLPP1表达可以降低食管癌细胞的存活，提示PHLPP1具有抑制食管癌细胞生长的作用。

肿瘤转移是肿瘤致死的重要原因。肿瘤细胞通过分泌基质降解酶破坏细胞外基质的完整结构，可从缺损的细胞外基质处进入血管，发生转移[14]。MMP因需要Ca、Zn等金属离子辅助而得名，是一个含有超过20个蛋白成员的庞大家族。MMP9是一种Ⅳ型胶原酶，是目前为止研究最为深入的基质金属蛋白酶，在肿瘤转移中发挥“钻头”作用。MMP1是一种间质胶原酶，在肿瘤组织中高表达，能够促进肿瘤细胞的转移[15-17]。本研究结果显示，上调PHLPP1后食管癌细胞中MMP9、MMP1蛋白表达减少，细胞的黏附、侵袭、迁移能力降低，说明上调PHLPP1可以抑制食管癌细胞降解细胞外基质，降低食管癌细胞的转移潜能。

人类有90%的恶性肿瘤起源于上皮组织，肿瘤细胞转移过程中常常表现为上皮细胞极性消失和间质细胞特性的出现。肿瘤细胞上皮间质转化是肿瘤转移的早期标志之一，上皮间质转化发生时，上皮标记物E-cadherin表达下调，而N-cadherin表达升高[18-20]。本实验的结果显示，上调PHLPP1后食管癌细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高，而N-cadherin蛋白表达水平降低，提示上调PHLPP1可以抑制食管癌细胞的上皮间质转化。

综上所述，PHLPP1在人食管癌上皮细胞中表达下调，上调PHLPP1表达可以抑制食管癌细胞上皮间质转化，抑制MMP的合成，降低食管癌细胞的黏附、侵袭和迁移能力。本实验只在一株食管癌细胞中进行了体外实验，后续会在多株食管癌细胞及体内进行验证。