DKK3基因过表达对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响

郭洪耀，乔军波，林 斌，沙树奎

1)南阳市中医院烧伤整形科 河南南阳 473000 2)郑州大学第三附属医院血管瘤外科 郑州 450052

瘢痕疙瘩是一种在皮肤组织受损后发生异常愈合的良性皮肤瘤[1-3]。皮肤成纤维细胞过度增殖、细胞胶原分泌过剩以及相关细胞因子过量表达，可导致结缔组织过度增生和变形，进而引发瘢痕的形成[4-5]。瘢痕疙瘩的形成往往伴随着皮肤疼痛和异常瘙痒，不仅破坏皮肤美观，还会给患者带来心理压力，严重影响人们的身心健康。目前，瘢痕疙瘩的主要治疗方法有药物、手术、激光、放射、冷冻等，然而单一的治疗手段效果不理想，复发率高[6]。瘢痕疙瘩形成的主要效应细胞为成纤维细胞。研究[7]表明诱导成纤维细胞的凋亡以及抑制成纤维细胞的增殖和胶原合成有助于改善瘢痕疙瘩。DKK3属于DKK家族中的一员，是一种重要的肿瘤抑制因子[8]。据报道[9-10]，DKK3在多种肿瘤中表达下调，上调其表达能够抑制癌细胞的增殖并促进其凋亡。本研究探索DKK3过表达对人皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响,以期为瘢痕疙瘩的防治提供实验依据。

1 材料和方法

1.1标本来源选取南阳市中医院烧伤整形科2011年1月至2017年12月21例瘢痕手术患者的皮肤瘢痕疙瘩组织；其中男12例，女9例，年龄15～30岁，病程6～12个月；取材部位：胸前4例，上肢11例，耳垂6例。所有患者均无瘢痕疙瘩治疗史，无合并皮肤病、结缔组织病，局部皮肤无感染和溃疡。正常皮肤组织20例取自同时期因烧伤进行皮肤移植术后的剩余皮肤；其中男13例，女7例，年龄23～35岁；取材部位：上肢内侧或腹部。所有患者均对本研究知情同意。

1.2主要试剂DEME-F/12培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)，CCK-8试剂(北京Solarbio科技有限公司)，cDNA反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)，Annexin V-FITC/PI试剂盒(大连Meilunbio生物技术有限公司)，DKK3、CAPDH一抗和HRP羊抗兔二抗(美国Abcam公司)，Lipofectamine 3000转染试剂盒(美国Thermo Fisher公司)，pcDNA3.0质粒(BioVector NTCC典型培养物保藏中心)，引物由Invitrogen合成。

1.3正常皮肤和瘢痕疙瘩组织中DKK3mRNA检测取冻存组织置预冷研钵，加液氮后研磨至粉末，移入匀浆器中，Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，以GAPDH为参照基因进行qRT-PCR。DKK3引物序列：上游5’-ACAGCCACAGCCTGGTGTA-3’，下游5’-CCTCCATGAAGCTGCCAAC-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火延伸30 s。用2-ΔΔCt计算DKK3 mRNA相对表达水平。

1.4人皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的获取和培养将去除表皮和皮下脂肪的瘢痕组织剪成1 mm3大小的组织块，用含有100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基，于体积分数5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养，3～4 d换液1次。待原代培养的细胞生长至单层时加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，继续传代培养。选取第4～6代的成纤维细胞进行后续实验。

1.5DKK3过表达质粒的构建和细胞转染使用Primer Premier 6.0设计含有HindⅢ和BamHⅠ酶切位点的DKK3引物，上游为5’-CCCAAGCTTATG CAGCGGCTTGGGGC-3’，下游为5’-CGCGGATC CCTAAATCTCTTCCCCTCCCAGCAGT-3’。以cDNA为模板扩增，之后使用酶切酶连的方式构建pcDNA3.0-DKK3质粒。成纤维细胞分别转染pcDNA3.0空质粒(pcDNA组)或pcDNA3.0-DKK3质粒(DKK3组)，未转染的细胞为对照组，每组设3个复孔。使用Lipofectamine 3000进行转染，操作步骤见说明书。

1.6Western blot检测3组细胞中DKK3蛋白的表达水平取转染48 h的各组细胞，离心收集沉淀，加入裂解液充分裂解后收集上清液，BCA法蛋白定量，沸水处理10 min后置冰中备用。取50 μg蛋白行120 g/L的SDS-PAGE，90 V电泳30 min，120 V至结束。将蛋白条带转移至PVDF膜，200 mA恒流转膜45 min。使用50 g/L牛血清蛋白封闭3 h，加1∶1 000稀释的一抗反应过夜，加1∶5 000稀释的二抗室温孵育1 h，化学发光法显色，拍照保存并使用Image J软件分析。以目的蛋白与GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达水平。

1.7CCK-8检测3组细胞增殖情况分别取转染24、26、48、72 h的3组细胞，调整细胞浓度为4×104个/mL，接种于96孔板，每组设3个复孔。37 ℃培养48 h后，加入10 μL的CCK-8试剂，酶标仪检测450 nm波长处的光密度(OD)值。

1.8Annexin V-FITC/IP双染法检测3组细胞凋亡情况取转染48 h的各组细胞，离心去除培养液，加入胰蛋白酶消化，离心收集沉淀，使用预冷的PBS重悬细胞，重复2次。最后加入Annexin V-FITC和IP染液，24 h内上流式仪检测。

1.9统计学处理应用SPSS 17.0分析，瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中DKK3 mRNA表达水平的比较采用两独立样本t检验，3组细胞增殖和凋亡情况比较采用单因素方差分析和SNK-q检验， 检验水准α=0.05。

2 结果

2.1瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中DKK3mRNA的表达瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中DKK3 mRNA的相对表达水平分别为(0.53±0.13)和(1.00±0.11)，差异有统计学意义(t=4.780，P=0.009)。

2.2各组细胞中DKK3蛋白的表达结果见图1和表1。DKK3组细胞中DKK3蛋白的表达水平显著上调。

1～3：分别为对照组、pcDNA组和DKK3组

组别nDKK3蛋白对照组31.00±0.06pcDNA组31.09±0.10DKK3组32.98±0.32∗

F=96.991，，P<0.001；*：与其他两组比较，P<0.05

2.3各组细胞增殖情况结果见表2。DKK3组细胞增殖能力降低(P<0.05)。

表2 各组细胞增殖情况比较(n=3)

*：与其他两组比较，P<0.05

2.4各组细胞凋亡情况对照组、pcDNA组和DKK3组细胞凋亡率分别为(15.5±1.2)%、(16.4±1.3)%和(26.3±0.2)%，差异有统计学意义(F=100.793，P<0.001)，DDK3组高于对照组和pcDNA组(P<0.05)。

3 讨论

瘢痕疙瘩是一种由成纤维细胞的异常增殖和胶原蛋白等细胞外基质的异常沉积造成的病理性疙瘩。近些年来，人们逐渐发现在瘢痕疙瘩中成纤维细胞的过度增殖和胶原的堆积沉淀可能与某些原癌基因和抑癌基因的突变有关[11-12]。本研究结果发现DKK3 mRNA在瘢痕组织中的表达水平下调，与Hahn等[13]报道的结果相一致。该研究结果提示DKK3可能在成纤维细胞的异常增殖中发挥着重要作用。

DKK3是近些年来新发现的一种抑癌基因，可以与Wnt信号传导因子竞争性结合从而参与调控该通路的功能。在DKK3的蛋白结构中包含两个富含半胱氨酸的结构域Cys-1和Cys-2，该区域是抑制Wnt通路的主要活性中心[14]。当细胞中Wnt与受体结合后，促使β-catenin从降解复合物上解离下来，β-catenin累积到一定量后进入细胞核中与TCF/LEF结合，Wnt/β-catenin通路被活化，进而发挥对靶基因的调控作用[15]。Wnt/β-catenin为Wnt的经典途径，参与了细胞增殖、凋亡等多种生物过程[16]。由此可见，DKK3对肿瘤细胞的生物学功能有着重要影响。过表达DKK3可抑制肺癌细胞的增殖和侵袭并诱导癌细胞凋亡[17]；在胰腺癌中DKK3表达显著下调，提高其表达水平能够抑制肿瘤生长并促进其凋亡[18]；在结肠癌中DKK3同样对癌细胞发挥着抑制作用[19]。该研究结果显示，成功上调DKK3表达能够显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖并诱导其凋亡。

综上所述，DKK3可能抑制瘢痕成纤维细胞的增殖并诱导其发生凋亡，丰富了瘢痕疙瘩发生发展的分子机制，也为以DKK3为靶点的瘢痕疙瘩的防治提供了实验依据。然而，关于DKK3在瘢痕成纤维细胞中介导了哪些信号通路和基因发挥抑增殖和促凋亡作用的还有待深入研究。