斑蝥素阻断核转录因子κB信号通路抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移

邱立强，夏豪，江洪，李雯静，吴刚，罗强，徐昌武

众所周知，动脉粥样硬化是包括心肌梗死和脑卒中在内的多种心脑血管疾病的病理基础，而血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖和迁移在动脉粥样硬化和血管再狭窄中起关键作用[1]。包括经皮腔内血管成形术、支架置入术等在内的介入治疗手段仍然是治疗心脑血管疾病的主要选择[2]。然而，因VSMCs迁移至内膜并过度增殖而导致的血管再狭窄时常发生，并最终导致手术失败[3]。研究表明核转录因子κB（NF-κB）介导的炎症反应在血管内再狭窄的发生和发展中起关键作用[4-5]。斑蝥素是我国传统中药斑蝥的主要活性成分，其对包括肺癌[6]、乳腺癌[7]以及黑色素瘤[8]等多种癌细胞的增殖和侵袭有显著的抑制作用，其中黑色素瘤细胞发挥作用与抑制NF-κB信号通路活性有关。但斑蝥素在心脑血管疾病，尤其是与VSMCs功能密切相关的动脉粥样硬化及血管再狭窄中是否也具有类似作用，一直以来却鲜有报道。为此我们通过脂多糖诱导VSMCs增殖和迁移，观察了斑蝥素对大鼠胸主动脉VSMCs增殖和迁移的作用以及对NF-κB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雄性大鼠（120～180 g），购自湖北省实验动物研究中心；脂多糖、二甲基亚砜（DMSO）和斑蝥素购自美国Sigma公司；DMEM/F12培养基、1×磷酸盐缓冲液（PBS，137 mmol/L氯化钠、2.7 nmol/L氯化钾和10 mmol/L 的 PBS，PH：7.3～7.5）购自美国HyClone公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司；双抗购自杭州吉诺公司；细胞毒性及增殖检测试剂盒（CCK-8）购自日本株式会社同仁化学研究所；碘化丙啶（PI）购买于上海生工；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自美国 ImmunoWay Biotechnology公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、BCA法蛋白浓度测定试剂盒、VSMCs表型标志蛋白（α-SM-actin）抗体及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自碧云天生物技术研究所；NF-κB p65（p65）、磷酸化NF-κB p65（P-p65）、NF-κB 抑制蛋白（IκB-α）抗体均购自美国CST公司；荧光二抗购自美国LICOR 公司；Trizol购自南京AIDLAB公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜购自美国merck-millipore，脱脂奶粉购自武汉谷歌生物科技有限公司。

1.2 方法

大鼠胸主动脉VSMCs 的分离培养和鉴定：采用组织块贴壁法培养原代大鼠胸主动脉VSMCs。原代培养用含15% FBS和1%双抗的DMEM/F12培养基，2天换液1次。传代后用含10% FBS的DMEM/F12培养基培养。用抗α-SM-actin抗体对VSMCs特异性的α-肌动蛋白进行免疫荧光染色鉴定，α-SM-actin阳性显色率达到95%以上。第3～5代细胞用于实验。

CCK-8检测细胞活性和确定脂多糖使用浓度：如文献[9]所述，具体步骤如下：（1）细胞活性检测，将细胞以2.0×104个/孔的密度接种在96孔板中。待细胞融合至80%时，换无血清培养基饥饿处理24 h，再与不同剂量（0、1.25、2.50、5.00和10.00 µmol/L）的斑蝥素或0.1%的DMSO共孵育24 h，然后向每孔加入10 µl CCK-8试剂（使CCK-8试剂含量为10%）继续培养2 h后，在酶标仪上（450 nm）测各孔的光密度（OD）值。（2）LPS使用浓度的确定，将细胞以2.0×104个/孔的密度接种在96孔板中。待细胞融合至60%时，换无血清培养基饥饿处理24 h，再与不同剂量（0、0.01、0.10、1.00、10.00和50.00 mg/L）的脂多糖共孵育24 h，然后向每孔加入10 µl CCK-8试剂（使CCK-8试剂含量为10%）继续培养2 h后，在酶标仪上（450 nm） 测各孔的OD值。每组设6个复孔。

实验分组：对照组、1 mg/L 脂多糖刺激组、脂多糖刺激后加用5 µmol/L斑蝥素组和脂多糖刺激后加用10 µmol/L斑蝥素组。

流式细胞仪检测细胞增殖：如文献[10]中所述，具体如下：将细胞接种于6 cm培养皿中，待细胞融合至60%左右时，饥饿处理24 h。后将各组培养基更换为含脂多糖和（或）相应浓度斑蝥素的1% FBS的培养基，继续培养24 h。接着用胰酶将细胞消化下来并离心，用PBS洗涤2次后加入预冷的70%的乙醇固定细胞并4℃过夜。取出细胞离心并用PBS洗涤细胞2次，然后加入0.4 ml PI稀释液（含50 mg/L的PI和100 mg/L的RNase A）室温避光孵育30 min，然后使用流式细胞仪（Becton Dickinson， 美国）检测各组细胞周期分布情况，并计算出各组细胞处于G1期，S期，G2期的比例。

Transwell实验检测各组细胞迁移[11]：用含有或不含有相应浓度斑蝥素的培养基将细胞密度调整为5.0×108个/L，然后每组每孔取200 µl种植于上室，下室加入600 µl含15% FBS的培养基，添加或不添加脂多糖，于培养箱中孵育12 h后取出；并将小室用PBS小心冲洗3次，并用棉签将小室内面未穿过的细胞轻轻擦去；用4%的多聚甲醛室温固定20 min后用PBS小心冲洗3次；然后将小室放入1 mg/L的DAPI中染色2 min，用PBS洗涤后在荧光显微镜（Olympus，日本）200倍下随机选取6个视野并拍照，最后使用Image J 1.51w software（NIH， 美国）软件计数穿过小室的细胞数。

蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达：蛋白抽提后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其蛋白浓度[12]，然后加入上样缓冲液煮沸后备用。按每孔30 µg总蛋白于预先配置好的10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行蛋白分离。然后电转至预先活化好的PVDF膜上。电转完成后用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h。PBST（1×PBS含0.1%的吐温-20）洗涤3次后，分别与IκB-α、p65、P-p65、GAPDH一抗4℃孵育过夜。取出PVDF膜用PBST洗涤3次，再与荧光标记羊抗兔二抗室温避光孵育1 h。取出PVDF膜，在避光环境下用PBST洗涤3次后使用Odyssey双色近红外激光成像系统（Li-Cor Biosciences， 美国）采集蛋白条带图像，测定灰度值通过校准GAPDH作为内参进行半定量分析。

实时荧光定量聚合酶链式反应法（q-PCR）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的信使核糖核酸（mRNA）表达水平：采用Trizol提取细胞总核糖核酸（RNA）。用反转录试剂盒（AMV，Promega公司）进行互补脱氧核糖核酸（cDNA）合成和扩增。相关基因的引物序列见表1。q-PCR法检测各基因mRNA表达。

表1 基因及引物序列

ELISA法测定培养液中TNF-α、IL-6浓度：各组细胞经脂多糖和（或）斑蝥素处理24 h后，收集各组细胞培养液后离心去除细胞碎片，按照ELISA试剂盒说明书操作，用酶标仪在450 nm 处测各组OD值。根据标准品的浓度和OD 值计算出标准曲线的回归方程式，并计算出样品中对应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中TNF-α、IL-6实际浓度。

统计学方法：以SPSS 22.0统计软件包进行统计学分析。结果以均数±标准差或率表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

大鼠胸主动脉VSMCs鉴定以及斑蝥素对VSMCs活性的影响：VSMCs特异性的α-肌动蛋白免疫荧光染色结果显示，α-SM-actin阳性显色率达到95%以上（图1），符合实验要求。CCK-8结果（图2A）显示，与DMSO比较，不同浓度（1.25、2.50、5.00和10.00 µmol/L）斑蝥素处理后的细胞活性差异均未见统计学意义（P均＞0.05）；斑蝥素浓度在10 µmol/L及以下时，不会对细胞活性产生影响，故以下实验斑蝥素剂量均不超过10 µmol/L。图2B显示，当脂多糖使用浓度为1 mg/L时VSMCs增殖能力显著提高，但随着脂多糖浓度的进一步增加其增殖能力增速减慢，故在本实验中选择脂多糖的浓度为1 mg/L。

图1 大鼠VSMCs免疫荧光染色鉴定(×400)

图2 CCK-8分析斑蝥素对大鼠VSMCs活性的影响以及脂多糖对VSMCs增殖的影响

斑蝥素对脂多糖诱导的VSMCs增殖的影响：图3显示，与对照组比较， 1 mg/L 脂多糖刺激组S期（蓝色斜线区域）细胞明显减少，而G2期（黄色区域）细胞占比明显增多（P均＜0.01）。然而，与1 mg/L 脂多糖刺激组比较，脂多糖刺激后加用10µmol/L斑蝥素组S期（蓝色斜线区域）细胞显著增多（P＜0.01），G2期（黄色区域）细胞占比明显减少（P＜0.05）。

图3 流式细胞仪分析斑蝥素对脂多糖诱导的大鼠VSMCs增殖的影响

斑蝥素对脂多糖诱导的VSMCs迁移的影响：图4显示，与对照组比较，1 mg/L 脂多糖刺激组穿出小室的细胞数增加46.3%（P＜0.01）；而脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素组和脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素组穿出小室的细胞数分别较1 mg/L脂多糖刺激组减少72.0%和90.4%（P＜0.01）；与脂多糖刺激后加用5 µmol/L斑蝥素组比较，脂多糖刺激后加用10 µmol/L斑蝥素组穿出小室的细胞数减少 65.9%（P＜0.01）。

Western blot结果（图 5） 显示：IκB-α 作为NF-κB通路激活的抑制蛋白，在1 mg/L 脂多糖刺激组其表达较对照组显著降低（P＜0.01），而加入斑蝥素后其表达随着斑蝥素浓度的增加而升高（P＜0.05）；与脂多糖刺激后加用5 µmol/L斑蝥素组比较，脂多糖刺激后加用10 µmol/L斑蝥素组IκB-α表达进一步升高50.8%（P＜0.05）。P-p65水平在脂多糖作用后表达较对照组明显增加（P＜0.05）；而经斑蝥素处理后其表达呈浓度依赖性受到抑制（P均＜0.05）；而T-p65水平在脂多糖诱导以及经斑蝥素处理后其表达差异均未见统计学意义（P均＞0.05）。

图4 Transwell分析斑蝥素对脂多糖诱导的大鼠VSMCs迁移的影响

图5 Western blot分析斑蝥素对大鼠VSMCs的NF-κB 信号通路相关蛋白影响

q-PCR和ELISA结果显示：q-PCR结果（图6A～C）显示，与对照组比较，1 mg/L 脂多糖刺激组细胞内TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平均显著升高（P均＜0.05）；与1 mg/L 脂多糖刺激组比较，脂多糖刺激后加用5 µmol/L斑蝥素组和脂多糖刺激后加用10 µmol/L斑蝥素组TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平均明显降低（P均＜0.05），另外与脂多糖刺激后加用5 µmol/L斑蝥素组比较，脂多糖刺激后加用10µmol/L斑蝥素组TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平较低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。ELISA结果（图6D～E）显示，与对照组比较，1 mg/L 脂多糖刺激组TNF-α、IL-6浓度均有明显升高（P均＜0.01），而脂多糖引起的TNF-α、IL-6浓度升高在斑蝥素处理后其浓度随着斑蝥素浓度的增加而降低（P均＜0.05）。

图6 q-PCR和ELISA测定斑蝥素对大鼠VSMCs促炎因子TNF-α、IL-6、MCP-1表达的影响

3 讨论

心脑血管疾病是全世界因疾病造成死亡的主要原因，严重威胁人类生命健康[13-14]。心脑血管疾病介入治疗虽在很大程度上改善了患者的预后，但支架置入引起的内皮损伤可显著促进白细胞、血小板和脂质颗粒等局部聚集导致炎症反应[15-16]。随之，白细胞、内皮细胞和VSMCs等产生促炎细胞因子，导致VSMCs增殖、迁移和细胞外基质形成并最终导致再狭窄[17]。因此抑制血管炎症反应，在治疗血管再狭窄中具有重要意义。

斑蝥素是我国传统中药斑蝥的有效提取成分，是一种选择性蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制剂[18]。PP2A 是细胞内最重要的磷酸酶之一，参与调控包括细胞增殖和转录等在内的多种重要的生理过程[19]。目前关于斑蝥素的研究主要集中在抗肿瘤方面，研究发现斑蝥素可抑制多种肿瘤细胞的增殖和侵袭，其发挥作用与抑制细胞内NF-κB p65核转位密切相关[20]。最近也有体外研究发现，斑蝥素可显著抑制人脐血管内皮细胞增殖，迁移和血管形成[18]。因此，我们推测斑蝥素与VSMCs过度增殖和迁移引起的血管再狭窄具有密切的联系，而这种联系与炎症反应相关。本研究通过体外分离培养大鼠VSMCs，用斑蝥素处理经脂多糖诱导炎症反应的VSMCs，结果发现斑蝥素可显著降低脂多糖诱导的VSMCs炎症反应，并抑制VSMCs的增殖和迁移。

众所周知，NF-κB信号通路在炎症相关疾病中扮演着重要的作用。NF-κB由p50和p65两个亚基组成。Landry等[21]发现，在大鼠颈动脉球囊损伤后p50和p65被激活，而它们的抑制性蛋白IκB-α水平显著降低。事实上，抑制NF-κB信号通路激活可抑制VSMCs增殖和迁移，从而减少血管损伤后新生内膜的形成[22]。这些结果与我们在体外研究结果基本一致。我们发现体外培养的VSMCs在脂多糖刺激后其NF-κB信号通路显著激活，其下游促炎因子包括TNF-α、 IL-6、MCP-1的表达显著增加，细胞增殖和迁移能力也明显增强；而在斑蝥素处理后胞内NF-κB抑制性蛋白IκB-α表达增加，NF-κB p65磷酸化受阻，TNF-α、IL-6、MCP-1的表达降低，细胞增殖和迁移能力也随之下降。这提示，斑蝥素可通过抑制NF-κB信号通路的激活而降低VSMCs的增殖和迁移能力。

总之，我们的实验结果表明，斑蝥素可显著抑制脂多糖诱导的VSMCs的增殖和迁移，而发挥作用的机制至少部分与斑蝥素抑制NF-κB信号通路激活有关。这为进一步研究斑蝥素对VSMCs生物学活性的作用奠定了基础，为治疗与VSMCs功能密切相关的动脉粥样硬化及血管再狭窄提供了理论基础。