异丙酚上调miR-21表达改善大鼠缺血/再灌注损伤学习记忆的机制

丰 亮,曹 苏

(1.南通市第二人民医院 麻醉科，江苏 南通 226002；2.南通大学附属医院 麻醉手术科，江苏 南通 226001)

异丙酚(propofol)是一种快速有效的全身麻醉剂，具有起效快、麻醉时间短、副作用小等临床特点，常被用于各科麻醉和重症病人的镇静。异丙酚对缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，如在小肠、肝脏、肾脏、心肌等[1-4]。异丙酚对脑组织缺血再灌注损伤也有保护作用[5-6]。有研究报道异丙酚可能激活细胞存活信号通路磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)，阻止海马锥体细胞死亡而发挥保护脑缺血再灌注的损伤[7]。然而异丙酚调控下游的信号通路及保护机制尚不清楚。微小RNA-21(miR-21)是一种研究较早的miRNA。miR-21的研究主要集中在调控肿瘤细胞的生物活性[8-9]。已有的报道指出大脑缺血再灌注损伤可能下调miR-21的水平促进神经细胞的死亡[10]。本研究主要解答异丙酚是否通过影响miR-21而发挥保护脑缺血再灌注损伤，并从细胞自噬的角度研究相关的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 Morris水迷宫(XR-XM101，上海欣软生物)，激光共聚焦显微镜(FV1000，OLYMPUS，日本)，Beclin1抗体(CST，美国)，LC3B抗体(CST，美国)，miR-21类似物(上海吉玛，中国)，异丙酚(批号：040607015，Fresenius Kabi公司，德国)。

1.2 大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型 清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠35只(体质量200～250 g)购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。自然光照，动物自由进食、饮水，室温控制在(22±2)℃。通过10%的水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后局部消毒备皮，沿颈部正中切口2～2.5 cm，然后分离颈总动脉，沿左侧颈总动脉分离颈外、颈内动脉，结扎并游离颈外、颈内动脉近心端。沿切口插入直径为0.3 mm尼龙线，将尼龙线轻轻插入颈内动脉，120 min后拔出。假手术组大鼠仅暴露、分离结扎血管。

1.3 实验动物及分组 实验分为4组(n=8)，分别为假手术组、模型组、异丙酚处理组、miR-21类似物组。异丙酚组为缺血后异丙酚治疗组，线栓阻断动脉血流成功后尾静脉滴注50 mg/(kg·h)(30 min)异丙酚；miR-21类似物组为线栓阻断动脉血流成功后经腹腔注射200 μL miR-21类似物，2 h后恢复大脑中动脉的血流。造模7 d后进行行为学、分子生化等实验。

1.4 Morris水迷宫 共经历时4 d学习，训练开始时，将平台置于第二象限。自由录像记录系统记录大鼠找到平台的时间(escape latency)，4次训练将大鼠分别从四个不同的起始点(不同象限)放入水中。大鼠找到平台后或60 s内找不到平台(潜伏期记为60 s)，则由实验者将其拿上平台，在平台上休息15 s，再进行下一次实验。第5天进行空间探索实验，撤除原平台，将大鼠任一个入水点记录大鼠1 min在平台所在象限停留的时间。

1.5 荧光定量PCR 收集损伤侧海马组织，提取RNA后根据逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以U6为内参，算出各组miR-21的相对表达量。引物序列如下。miR-21：Forward 5′-TGTACCACCTTGTCGG-3′，Reverse 5′-TGCTGTTGCCATGAGAT-3′；U6：Forward 5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′；Reverse 5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′。

1.6 免疫印迹 将海马组织置于2 mL匀浆器中，加400 μL单去污剂裂解液(含PMSF)于匀浆器中匀浆，然后置于冰上，裂解海马组织。将裂解液移至1.5 mL离心管，然后在4 ℃下12 000 r/min离心5 min，取上清分装于0.5 mL离心管中并置于-20 ℃保存。将样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以55 V恒压电泳，使样品压缩至浓缩胶与分离胶界面，改电压为110 V继续电泳。在200 mA条件下转膜150 min；5%脱脂奶粉室温摇床震荡封闭3 h；一抗(1∶1000)置于摇床4 ℃孵育过夜；二抗(1∶5000)室温摇床震荡孵育2 h。ECL显色试剂显色，Fluor Chem FC3化学发光成像系统曝光；Image J软件分析。

1.7 免疫荧光 大鼠海马组织经4% PFA固定24 h后，再经30%蔗糖脱水，冰冻切片，PBS润洗，10%山羊血清室温封闭1 h，加入相应浓度一抗4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次，二抗室温避光孵育2 h后，加DAPI孵育10 min，PBS避光清洗3次，贴片，晾干加封片剂封片，激光共聚焦显微镜下摄片，计算平均荧光强度(MFI)。

1.8 统计学分析 应用GraphPad Prism 6.0统计学软件进行统计分析，数据符合正态分布的应用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差和重复测量的方差分析，多组间两两比较采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异丙酚处理提高缺血/再灌注损伤模型miR-21、Beclin 1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达 结果显示，模型组miR-21的表达低于假手术组(P<0.05)，而异丙酚组和miR-21类似物组miR-21的表达高于模型组(P<0.05)；模型组Beclin 1/β-actin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1 MFI高于假手术组(P<0.05)，而异丙酚组和miR-21类似物组Beclin 1/β-actin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1 MFI低于模型组(P<0.05)。见表1，图1、2。

组别miR-21Beclin 1/β-actinLC3-Ⅱ/LC3-ⅠBeclin 1 MFI假手术组1.00±0.040.29±0.100.22±0.081.00±0.00模型组0.45±0.13*0.62±0.07*0.41±0.06*1.40±0.15*异丙酚组1.11±0.15#0.29±0.09#0.24±0.04#1.02±0.06#miR-21类似物组1.20±0.12#0.34±0.15#0.25±0.09#1.01±0.10#F65.50217.65312.45333.765P0.000.000.000.00

注：和假手术组比较，*P<0.05；和模型组比较，#P<0.05。MFI：平均荧光强度。

2.2 异丙酚处理改善缺血/再灌注模型学习记忆 结果显示，寻找平台潜伏期各组有随着时间下降的趋势(P<0.05)，假手术组和miR-21类似物组寻找平台潜伏期第2天、第3天、第4天较对应组前一天均下降(P<0.05)；模型组和异丙酚组第3天、第4天较第1天、第2天下降(P<0.05)。训练前3天各组间没有差异(P>0.05)，训练第4天模型组、异丙酚组与假手术组间有差异(P<0.05)，miR-21类似物组和模型组有差异(P<0.05)，见表2、3。第5天的记忆测试结果显示，模型组、异丙酚组和miR-21类似物组停留在平台象限的时间较假手术组减少(P<0.05)；和模型组比较，异丙酚、miR-21类似物处理能提升平台象限停留时间(P<0.05)，详见表4。

组别寻找平台潜伏期/s第1天第2天第3天第4天假手术组55.32±5.9944.52±5.99a30.12±4.07ab16.92±4.60abc模型组54.94±3.5847.98±3.6137.82±7.01ab34.72±10.46ab*异丙酚组58.10±2.5052.60±8.6934.72±6.20ab29.08±11.86ab*miR-21类似物组58.40±2.6345.42±6.29a33.28±7.07ab24.18±9.26abc#

注：和假手术组比较，*P<0.05；和模型组比较，#P<0.05。和第1天比较，aP<0.05；和第2天比较，bP<0.05；和第3天比较，cP<0.05。

表3 重复测量的方差分析结果

ANOVA tableSSDFMSFP时间16 605.0035535.002005.000.00组别526.903175.6038.400.00时间×组别801.80989.0823.630.00

组别目标象限停留时间/s假手术26.40±4.83模型组9.60±2.79*异丙酚组20.40±1.95*#miR-21类似物组17.80±2.39*#F38.26P0.00

注：和假手术组比较，*P<0.05；和模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

本研究结果提示在缺血后给予异丙酚能够改善再灌注引起的学习记忆下降。研究首次报道了MCAO模型海马组织miR-21的表达水平下降，而异丙酚能够逆转miR-21水平下降。然而，异丙酚也被报道具有一定的神经毒性，主要体现在影响神经发育[11]或者影响神经干细胞的转化[12]。因此，本研究认为控制异丙酚的剂量可能是一种重要的保护成年缺血再灌注损伤的策略。

1，2，3，4分别是假手术、模型、异丙酚和miR-21类似物组。

图1 异丙酚处理降低中动脉缺血/再灌注引起的细胞自噬死亡相关蛋白的表达

A.假手术组；B.模型组；C.异丙酚组；D.miR-21类似物组。

图2 异丙酚处理降低中动脉缺血/再灌注引起的Beclin1的表达

实验中，模型组训练逃避潜伏期较假手术组没有明显的影响，而在平台停留期时间缩短，指出记忆功能的下降。本研究发现异丙酚能够降低MCAO引起的记忆下降。缺血再灌注的损伤主要体现在再灌注的冲击。缺血过程在整个过程可能起着一定的保护作用，但不足以逆转再灌注的损伤；而在缺血过程，给予异丙酚能够加强这种保护作用。研究发现miR-21在模型组表达下降，在缺血阶段使用miR-21类似物也能抑制再灌注造成的损伤。

脑缺血再灌注损伤能引起神经细胞自噬性死亡[13]。本研究检测细胞自噬相关的经典蛋白Beclin1和LC3的表达，通过免疫印迹和免疫荧光技术发现MCAO能促进细胞自噬性死亡，而异丙酚处理降低自噬性死亡相关蛋白的表达。与此同时，miR-21类似物也能降低MCAO造模引起的自噬性死亡蛋白的表达。尽管预缺血能够引起细胞自噬，而且自噬在缺血再灌注损伤中扮演着保护的角色，适度和过度的自噬对于神经功能的作用是相反的。前期的研究报道了异丙酚通过抑制PTEN发挥保护脑缺血再灌注的损伤。而且，miR-21可能通过调控PTEN/AKT/mTor通路影响细胞自噬[14]。本研究提示该过程或信号通路在脑缺血再灌注损伤过程发挥相似的作用。异丙酚通过上调miR-21从而阻止缺血再灌注模型海马细胞的程序化死亡和学习记忆下降。