家猪脱髓核细胞基质的制备及其生物相容性评价

徐子昂，刘 晨，肖 良，王 效，徐宏光

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 脊柱外科,安徽 芜湖 241001)

下腰痛，顾名思义，多指腰骶部的疼痛，是脊柱外科常见的一种疾病，严重影响患者的生活质量，更有甚者，会导致劳动能力的丧失[1-2]。椎间盘退变是引起下腰痛的主要原因[3]，但具体发病机制尚未明确。根据有关报道，遗传基因[4]、年龄[5]、营养流失[6]、负重[7]等是椎间盘退变的重要风险因素。

目前，临床上对椎间盘退变性疾病的治疗，无论是缓解症状为目的的药物或物理治疗，还是以恢复椎体稳定结构为目的的外科手术治疗，结果均不理想[8]，而生物学疗法为椎间盘退变的治疗带来了新思路，其中以组织工程替代品置换为椎间盘退变性疾病治疗带来了新希望[8-11]。近年来生物材料技术的发展提高了人类组织或器官在退变或死亡过程中的修复和再生能力，在各种生物材料中，脱细胞基质材料支架的使用越来越广泛，它保持了各种组织器官的天然形态、细胞外基质构成和框架构成，并经去细胞步骤去掉本身的免疫原性，可以负载各种需要的细胞、细胞因子[12]和药物[13]等。

本实验通过一定方法从猪髓核组织中获得脱髓核细胞基质，并鉴定其物理特性及其生物相容性，以期为后续的支架构建及治疗椎间盘退变奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂 0.25%含有EDTA的胰蛋白酶(Gibco)、TritonX-100(Sigma)、DAPI染色液(Solarbio)、核糖核酸(RNA)酶(Solarbio)、脱氧核糖核酸(DNA)酶、CCK-8增殖试剂盒(凯基生物)、酶标仪(iMark，BIO-RAD)、扫描电镜(HITACHI S-4800)。

1.2 实验方法

1.2.1 脱髓核细胞基质的制备 髓核位于上下椎体中间的椎间盘组织中的最中央，分离购买的新鲜家猪脊柱周边的肌肉组织，从正中切开椎体之间的椎间盘，刮下髓核组织，使用PBS冲洗干净，加入质量浓度为0.25%的胰酶溶液，置于温度为37°C，摇晃速度为150 r/min的摇床中。每6 h换液1次，持续3 d。接着再次使用PBS冲洗，每次30 min,再加入浓度为1%的Triton-100消化24 h，继续使用PBS进行冲洗，最后加入含有核酶溶液(含有50U/mL DNAase和1U/mL RNAase,溶于tri-HCL,pH=7.5)继续消化24 h后，使用PBS冲洗6次，每次30 min。

1.2.2 扫描电镜下观察脱髓核细胞基质 制备一定浓度的醋酸溶液，将获得的脱髓核细胞基质溶解，并用磁力搅拌过夜，吸取500 μL悬液加入24孔板，自然风干后，加入浓度为0.1%的Tritonx-100使细胞膜通透性增高，PBS溶液接着冲洗3次，每次5 min，然后加入500 μL DAPI染液避光条件下染色8 min，PBS冲洗3次，倒置相差荧光显微镜下观察细胞核的残留情况。使用不同浓度的乙醇阶梯脱水，每个阶梯浓度脱水20 min，超临界点干燥6 h，喷金，制样成功后进行电镜扫描，观察脱细胞效果及脱髓核细胞基质的形态特点。

1.2.3 脱髓核细胞基质的细胞相容性评价 将已溶于一定浓度醋酸的脱髓核细胞基质，按照每孔50 μL加到96孔板中，充分震荡使脱髓核细胞基质悬液均匀铺在孔底，自然条件下风干，紫外线照射24 h进行灭菌处理。该实验分为两组，每组各取5块96孔板，实验组将大鼠骨髓间充质干细胞按照5×103个/孔接种于铺被脱髓核细胞基质的96孔板上，对照组直接将间充质干细胞接种于96孔板，每孔接种相同的细胞密度。置于培养箱培养，1 d后，每孔加入40 μL CCK-8溶液，置于避光环境下2 h，置于酶标仪上，选择450 nm波长检测两组各孔的吸光度，按照上述步骤连续检测2、3、4、5 d的细胞增殖情况。

计算细胞相对增殖率(RGR)(%)=(实验组吸光度平均值/对照组平均值)×100%。分为6级：RGR相对增殖率≥100%，细胞毒性分级为0级，75%≤RGR<100%为1级，50%≤RGR<75%为2级，25%≤RGR<50%为3级，1%≤RGR<25%为4级，RGR<1%为5级。0～1级表示细胞增殖能力优秀，脱细胞基质膜对细胞增殖基本无影响；1～2级表示细胞增殖能力良，脱细胞基质膜对细胞增殖产生部分影响；3～4级表示细胞增殖能力一般，脱细胞基质膜对细胞增殖产生较大影响；5级表示细胞增殖能力差，脱细胞基质膜对细胞增殖产生严重影响。

2 结果

2.1 脱髓核细胞基质的外观特征 分离出的髓核组织肉眼观察呈半透明的胶质状(图1A)。在分离中，位于颈椎间盘的髓核比位于腰椎间盘的髓核组织更加透明。而经脱细胞处理后，组织含量大大降低，肉眼观察呈乳白色的糜状(图1B)。

A.家猪未退变的髓核组织，呈半透明状;B.家猪髓核组织经脱细胞方法处理后，呈乳白色。

图1 髓核组织经脱细胞前后的形态变化

2.2 脱髓核细胞基质的结构特征 将获得的脱髓核细胞基质溶于醋酸，通过制备脱髓核细胞基质膜并使用DAPI染色，显微镜下观察无细胞核被染成蓝色(图2A)，说明髓核组织经脱细胞后效果良好，无明显细胞残留，达到预期实验标准。在扫描电镜下，明显观察到髓核组织经脱细胞后，由许多无序排列的胶原纤维组成(图2B)。且能够更进一步证实，脱细胞后无细胞残留。

A.DAPI 染色，显微镜下未见到有染成蓝色的细胞核,标尺为100 μm;B.扫描电镜下，可以看出脱髓核细胞由无序的胶原纤维排列而成，标尺为50 μm。

图2 脱髓核细胞的DAPI染色和电镜观察

2.3 脱髓核细胞基质的细胞相容性 通过5 d的细胞增殖检测及绘制的增殖曲线发现，实验组与对照组具有相似的增殖趋势(图3)，说明骨髓间充质干细胞种植于脱髓核细胞基质和对照组相比，同样具有分裂增殖能力。计算细胞相对增殖率，根据表1进行评级，实验组骨髓间充质干细胞前2 d内细胞毒性评级分别为1级和2级，表明实验组的增殖速度略低于对照组；第3～4天内评级为0级，表明实验组增殖速度大于对照组，第5天内细胞评级为1级，表明实验组增殖速度稍低于对照组，通过评级，骨髓间充质干细胞与脱髓核细胞基质膜具有很好的生物相容性。

绿色曲线代表实验组，红色曲线代表对照组。

图3 大鼠骨髓间充质干细胞在脱细胞髓核基质膜上的增殖曲线

3 讨论

在分离家猪的髓核组织过程中，我们发现同一家猪个体的不同节段的髓核组织肉眼观察具有很大的区别，比如在脊柱的腰椎段，髓核组织呈半透明状，而在颈胸椎段，髓核组织多呈透明状。这可能与退变的程度有关，因此，在选材上，应尽量选择腰椎段的髓核组织。另外，在进行脱细胞的过程中，需要的髓核组织较多，因此选材的量要足够才行。

表2 两组第1～5天吸光度值与细胞毒性分级

培养时间实验组 对照组RGR/%评级第1天0.193±0.0410.251±0.03076.91级第2天0.236±0.0240.374±0.02763.12级第3天0.464±0.0410.436±0.096106.40级第4天0.602±0.1120.533±0.122112.90级第5天0.526±0.0490.566±0.06992.91级

通过电镜扫描，发现髓核经脱细胞后，由大量无序的胶原纤维构成，这为我们后期的实验奠定了良好的基础。当然，本实验也存在一些不足之处。比如未对脱髓核细胞基质的组成、是否含有细胞因子进行分析等，在后期的实验中，我们将会弥补并做相关的检测。

在检测脱髓核细胞基质的生物相容性时，我们遇到的最大问题就是如何对材料进行灭菌处理，良好的灭菌是进一步实验的基础，因为只有这样细胞才能不被污染地长于基质膜上。60Co及紫外线照射可以做到对材料的基本灭菌处理，但是60Co灭菌成本较大，对基础设施条件要求高，于是我们对紫外线照射灭菌法进行了大量的实验，发现紫外线照射灭菌的效果随着照射时间的延长而递增，因此，我们选用了紫外线照射24 h灭菌处理，灭菌效果能够达到实验的要求，骨髓间充质干细胞接种于基质膜上时无污染发生。而在后期将骨髓间充质干细胞种植于脱髓核基质膜上时，由于先前脱髓核细胞基质是溶解于醋酸中的，因此我们预先加入含有5%双抗的培养基不断进行浸泡，直到培养基不变色。

生物相容性是指材料在宿主的特定环境和部位，与宿主直接或间接接触时所产生相互反应的能力。目前评价材料相容性的方法有两类，一类为体外细胞直接接触培养法，另一类是动物体内组织相容性检测。细胞实验较体内植入实验更加客观和准确，是近年来研究生物相容性的主要方法。本实验通过计算相对增殖率，能够将实验组与对照组的差异量化出来，并且通过评级系统来判断这些差异是否影响到细胞在材料上的增殖情况，本实验表明了骨髓间充质干细胞与脱髓核细胞基质膜具有很好的生物相容性，为选择生物组织工程支架材料提供了理论依据。

脱髓核细胞基质作为组织工程椎间盘支架来源，仍存在一些不足之处[14]。第一，目前制备的脱髓核细胞基质大都孔隙率较低、孔径较小，合适的孔径是细胞迁移形成正常髓核团簇状分布的前提[15]。

第二，目前脱细胞髓核支架暂停留在支架的制备及性能检测，未接种种子细胞在体外及体内构建出椎间盘[16]。第三，脱髓核细胞基质本身会不会对种子细胞向髓核细胞分化具有诱导作用，以及对髓核细胞表型具有维持作用？需要接下来进一步研究。目前脱髓核细胞基质构建组织工程椎间盘的研究还处于初步阶段，相信通过后续临床研究和体外研究的深入，脱髓核细胞基质作为组织工程基质具有良好的发展前景。