沙利度胺影响肿瘤坏死因子受体表达对大鼠慢性坐骨神经缩窄的镇痛效应

苏晓英 陈素明 周飞仁 王清秀

(1绵阳市第三人民医院 四川省精神卫生中心，四川 绵阳 621000；2同济大学医学院附属上海市东方医院麻醉科)

凡涉及躯体感觉神经系统的损伤或疾病而引起的慢性疼痛即神经病理性疼痛(NP)〔1〕，其临床表现以疼痛过敏、感觉异常、自发性疼痛等为主要症状，患者常因剧烈疼痛而痛苦不堪〔2,3〕。对于NP的发病机制，目前国内外的探究热点主要围绕分子神经生物学机制，包括炎症介质作用、中枢敏化、中枢去抑制等〔4,5〕。其中，炎症介质作用中研究较为普遍的是细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)〔6〕，而TNF受体(TNFR)的表达来体现其效应高低〔7,8〕。可见，体内TNFR(包括TNFR1、TNFR2)表达水平与NP发病密切相关，在伤害性信号传导通路中起关键作用。沙利度胺曾因其强致畸作用引起新生儿先天性四肢残缺而一度被禁用，现代医学研究发现在一定剂量下，沙利度胺具有镇静止痒、免疫调节、抗肿瘤等多方面的作用〔9,10〕。沙利度胺可减弱TNFR1、TNFR2 mRNA及蛋白的表达并调节TNF诱导的其他细胞因子分泌〔11〕，减轻炎症反应，这极可能与其镇痛机制相关。而目前沙利度胺与TNFR表达对NP的镇痛作用尚未得到验证，其剂量效应关系需要进一步探究。本文拟分析慢性坐骨神经缩窄(CCI)大鼠不同剂量下沙利度胺对TNFR表达水平的影响，以评估沙利度胺与TNFR的镇痛效果。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 清洁级成年雄性SD大鼠50只，体重200～250 g，购于上海西普尔必凯实验动物有限公司。随机分为5组各10只：假手术组(S组)、CCI组(C组)、低剂量沙利度胺组(L组)、中剂量沙利度胺组(M组)、高剂量沙利度胺组(H组)。S组暴露坐骨神经不结扎，其余4组建造CCI模型。

1.2大鼠CCI模型建造 实验大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，固定于手术台并确保器械消毒；在大鼠右下肢股后中部切开皮肤，沿肌肉纹理钝性分离股二头肌进而暴露坐骨神经干。近分叉处采用铬制肠线做4个疏松结扎，每个结扎环间距大约1 mm。结扎程度以大鼠大腿肌肉轻微抽出为标准，不影响血管血运。创面消毒冲洗后逐层缝合，术后分笼喂养。

1.3术后处理 根据预实验结果，L组剂量20 mg/kg，M组50 mg/kg，H组100 mg/kg；采用固定灌胃器每日1次处理实验大鼠，术后灌胃持续1 w。

1.4大鼠机械性痛阈与热痛阈测定 机械性痛阈测量：所有大鼠于手术前，手术后1、2、3及4 w测定并记录其机械性痛阈与热痛阈。机械性痛阈采用von Frey纤维，使尼龙纤维毛垂直刺激大鼠右足底皮肤，逐渐加压，刺激持续时间不超过4 s；阳性反应为大鼠出现添足、缩足、抬足等躲避行为，反之为阴性反应，以出现阳性反应的压力值为机械性痛阈。操作重复5次，取其平均值。

热痛阈测量：热痛阈以红外线为辐射源，将实验大鼠置于辐射热测痛仪中，稳定5 min后，红外线照射大鼠右侧足底部皮肤，记录大鼠出现缩足的潜伏期并防止过度辐射烫伤大鼠。重复操作3次，每次间隔10 min，取平均值。

1.5TNFR表达产物测定 于手术后第4周，处死所有实验大鼠，取其脊髓背角组织，测定其TNFR1、TNFR2 mRNA及蛋白质含量。

1.5.1Western印迹检测TNFR蛋白含量 采用GE蛋白印迹系列仪器，一抗TNFR1、TNFR2单克隆抗体及二抗辣根过氧化物酶标记单克隆抗体购于碧云天生物有限公司。

脊髓背角组织经机械分散后溶于十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶加样缓冲液，于4℃，1 200 r/min离心15 min，取上清液作为检测样品并按常规方法进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)；用转膜缓冲液平衡5 min后转膜，将蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；加入封闭液(5%脱脂牛奶)室温下封闭2 h；弃封闭液，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜3次，每次5 min；浸入第一抗体溶液液(稀释1∶1 000)TNFR1、TNFR2兔抗人单克隆抗体，4℃反应12 h；次日弃一抗，0.01 mol/L PBS洗膜，加入辣根过氧化物酶二抗稀释液，室温下反应1 h。以β-actin蛋白为内参蛋白，分析4组蛋白相对表达量。

1.5.2实时荧光定量PCR测定TNFR mRNA含量 采用ABI stepone Real-time PCR仪，总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购于北京天根有限公司。Trizol试剂提取组织上清液样本总RNA，加入等体积异丙醇后振荡混匀，离心10 min，收集沉淀。75%乙醇清洗沉淀，超净台风干，而后用焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解，逆转录合成cDNA。选用β-actin为内参基因，检测各组TNFR1、TNFR2 mRNA的Ct值，运用公式2-△△CT计算4组目的基因的相对表达量，操作重复3次。实验中，内参基因及各目的基因引物序列如表1。

1.6统计方法 应用SPSS19.0软件进行重复测量方差分析和Pearson相关性分析。

表1 实时荧光定量PCR检测TNFR基因表达的引物序列

2 结 果

2.1术后不同时间点下各组机械性痛阈与热痛阈的变化 S组在术前术后的机械性痛阈与热痛阈均无明显改变(P>0.05)，其余4组术后痛阈、热阈均有明显下降(P<0.05)；C组术后第4周时机械性痛阈较术后第1周明显升高(P<0.05)，而术后其他时间点下的机械性痛阈与术后各时间点的热痛阈无明显差异(P>0.05)；L组、M组、H组在术后机械性痛阈、热痛阈随时间呈上升趋势(P<0.05)。术后C组对比S组，机械性痛阈与热痛阈明显降低(P=0.000)；C组术后的机械性痛阈、热痛阈显著低于L组(P<0.01)；机械性痛阈、热痛阈相比，H组显著高于M组(P=0.000)，M组显著高于L组(P=0.000)，见表2。

2.24组TNFR1、TNFR2 mRNA及蛋白相对表达 与C组比较，L组、M组及H组TNFR1 mRNA和蛋白含量均明显降低(P<0.05)；H组TNFR1基因表达产物含量最低，其次为M组，L组相比于前两组，TNFR1 mRNA与蛋白表达水平略高(P<0.05)；而各组TNFR2基因表达产物，mRNA与相应蛋白含量无明显差别(P>0.05)，见表3、图1。

表2 各组不同时间机械性痛阈、热痛阈测量值

机械性痛阈F①-②组内=15.103,P①-②组内=0.000;F②-③组内=7.287,P②-③组内=0.000;F③-④组内=6.432,P③-④组内=0.000；F④-⑤组内=8.045,P④-⑤组内=0.000；热痛阈：F①-②组内=11.651,P①-②组内=0.000;F②-③组内=3.393,P②-③组内=0.001;F③-④组内=5.445,P③-④组内=0.000；F④-⑤组内=5.673,P④-⑤组内=0.000；与术前相比：1)P<0.05；与术后第1周相比：2)P<0.05

表3 4组TNFR mRNA及蛋白表达比较

1)与C组相比；2)与L组相比；3)与M组相比:均P<0.05

图1 4组TNFR1蛋白印迹

2.3沙利度胺剂量浓度与TNFR1 mRNA相对表达水平的相关性 随着沙利度胺浓度的增加，组织细胞中mRNA相对表达水平不断下降，二者呈明显负相关(r=-0.497，P=0.036)，见图2。

图2 沙利度胺浓度与TNFR1 mRNA相对表达水平的相关性

3 讨 论

目前，临床治疗NP的首要原则是缓解患者疼痛，而传统的镇痛药却难以达到理想效果，阿片类药物虽效果明确，但其不良反应严重，无法成为一线药物〔12〕，而非甾体抗炎药只对部分患者有效，其安全性尚未得到证实〔13〕。现今较为深入研究的细胞机制有伤害性疼痛传导通路及其相关的基因、蛋白、细胞因子等，其中，促炎细胞因子TNF因在伤害性传导通路中起关键作用备受关注〔14,15〕。而TNF的最终作用效应由其受体水平决定〔16〕，因此，TNFR表达水平与NP存在密切关系。

沙利度胺是临床常见的镇静药，具有镇静、止痒、抗炎、抑制血管生成的功能〔17,18〕。Moreira 等〔19〕在所研究的动物模型中提出沙利度胺的镇静机制极可能是通过下调TNFR水平实现的。机械性痛阈与热痛阈是大鼠CCI模型中常见的测量指标〔20,21〕，其测量值能较好地反映大鼠疼痛程度，间接反映药物的镇痛效果。本研究提示沙利度胺的镇痛效应极可能与其剂量相关，剂量高，镇静效果相对较好。

TNFR包括TNFR1、TNFR2两大类，两者介导不同的信号传导途径，其中，TNFR1可表达于所有类型的细胞上，与TNF结合发挥生物活性；而TNFR2的功能与结构尚未得到深入剖析。本实验提示沙利度胺可能具有下调TNFR1表达水平的功能，且TNFR1表达水平受沙利度胺剂量的影响，这极可能与沙利度胺对大鼠NP模型的镇痛机制相关。TNFR2并不作用于伤害信号转导通路，对TNF的生物活性无明显影响。本文提示不同剂量的沙利度胺可能影响TNFR1 mRNA的表达，随着沙利度胺剂量的升高，抑制TNFR1 mRNA水平的效果越明显。

本实验尚有不足之处，研究剂量过少，大鼠NP模型单一；同时，伤害传导通路涉及基因、细胞因子较多，沙利度胺是否完全通过下调TNFR mRNA及蛋白对NP大鼠产生镇痛效果尚未可知，是否存在其他影响因子尚不明确。日后的实验中将细分沙利度胺浓度、纳入更多大鼠NP模型，进一步研究沙利度胺对NP大鼠模型的影响及作用机制。

综上，沙利度胺可能通过影响TNFR1表达对大鼠CCI模型产生镇痛效应，且其剂量与TNFR1表达水平可能相关，有望作为神经病理性疼痛的治疗靶点之一，具有潜在临床治疗价值。