应用组织芯片技术分析53BP1在结肠癌中的表达及意义

孙 涛，张 园，朱长军

（1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学 天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387；3.新疆医科大学附属肿瘤医院 肿瘤防治研究所，乌鲁木齐 830011）

结肠癌作为全球最常见的消化系统恶性肿瘤，患者死亡率在常见的恶性肿瘤患者死亡率中位居第2位[1]，在我国的年均发病率高达4%[2].近年来，结肠癌患者数量不断增加，年龄逐渐趋向年轻化，且男性发病率大于女性[3].目前，对结肠癌早期诊断的水平仍较低，如传统的免疫法粪便隐血试验、CT 仿真结肠镜、胶囊结肠镜等技术，均存在特异性差、假阳性高、适用范围狭窄等缺点[4-7].据统计，近1/3 患者确诊时已处于结肠癌的进展期或晚期.Shane 等[8]研究表明，早期结肠癌患者愈后5年生存率为80%，进展期结肠癌患者愈后5年生存率仅为50%.因此选择适当的早期肿瘤标志物进行联合检查，提高早期结肠癌诊断率，成为延长结肠癌患者生存率的重要手段[9].

细胞基因组稳定性对细胞的正常生长增殖至关重要.如果细胞增殖过程中发生DNA 损伤又不能及时修复，就会导致细胞走向死亡或引起基因组不稳定，最终诱发肿瘤.细胞为保护基因组的稳定性不被DNA 损伤所破坏，进化出了精密的DNA 损伤修复机制.其中，对于DNA 双链损伤（DSBs）的修复主要由末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HR）2 个途径完成.NHEJ 途径贯穿整个细胞周期，HR 却只出现在S/G2期[10].HR 途径能确保DSBs 处修复后与原本序列一致，从而保证了基因组的完整性和稳定性.因此，参与调控HR 途径的关键蛋白既是目前DNA 损伤修复研究领域的热点，也是参与肿瘤发生发展的重要蛋白.p53 结合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）是HR 途径上的一个成员，DNA 发生双链断裂损伤时，磷酸化修饰后的53BP1 如果聚集到DSBs 处，会阻止HR 的进行[11-13].53BP1的高表达或功能异常往往会造成细胞基因组不稳定，引起肿瘤的发生.

为了深入研究53BP1 蛋白分子与结肠癌发生发展之间的关系，本课题组尝试了几种市场化的抗53BP1 蛋白抗体，细胞水平的预实验结果显示这些抗体均不能满足实验需要.为此，本研究设计了53BP1蛋白分子的抗原多肽并将其应用于特异性抗53BP1多克隆抗体的制备.应用该抗体对31例结肠癌组织及其癌旁组织进行免疫组化检测，结合临床病例资料分析和ONCOMINE数据库检索，探究53BP1 在结肠癌组织中的表达情况.本研究结果将为53BP1 应用于结肠癌的早期诊断提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

骨肉瘤细胞株U2-OS、人子宫颈癌细胞株Hela 均为本实验室自存.

1.1.2 试剂

蛋白预染Marker，日本Takara 公司；胎牛血清、胰蛋白酶，美国GIBCO 公司；HRP 标记的二抗，美国Invitrogen 公司；细胞完全培养基DMEM，北京钮因华信科技发展有限公司；免疫组化试剂盒，美国BOSTER公司；结肠癌组织芯片，武汉谷歌生物科技有限公司（芯片编号：DZX2017.9）；Protein A 耦联的琼脂糖凝胶柱，上海碧云天生物技术有限公司；抗53BP1抗体的抗原多肽CIEDSQPESQVLEDD（根据53BP1 蛋白分子一级结构中的第21 位至第35 位氨基酸设计制备），由武汉丹港生物科技有限公司合成.

1.1.3 仪器

蛋白电泳仪，美国Bio-Rad 公司；Nikon TS-100 FL倒置荧光显微镜和Nikon 90i 共聚焦荧光显微镜，日本Nikon 公司.

1.2 方法

1.2.1 抗体制备

设计合成抗原多肽CIEDSQPESQVLEDD 并将其偶联到载体血蓝蛋白（KLH）上，与抗体佐剂以1 ∶1 的体积比混匀，皮下注射入新西兰大白兔背部.第一次注射抗原多肽前，耳缘静脉取血作为免疫前血清.每次注射抗原多肽一周后，耳缘静脉取血制备血清并进行血清验证，一直持续3～5 个月.血清验证得到高滴度的特异性抗53BP1 抗体后，将兔子从股动脉放血，得到终血清（约50 mL）.

1.2.2 抗体血清验证

将长满10 cm2平皿的U2-OS 细胞（约8.8×107）置于冰上，吸去培养基，PBS 洗3 次，加1 mL 的PBS并用干净的细胞刮沿同一方向将细胞收集到1.5 mL离心管中.在4 ℃、1 000 r/min 条件下，离心3 min，吸去PBS.用880 μL 的RIPA 裂解液将细胞沉淀吹吸均匀，置于冰上1 h.将细胞裂解液于4 ℃、14 000 r/min 条件下离心30 min，取上清液200 μL 并加入1 μL 血清，4 ℃下孵育过夜.次日取20 μL 的Protein A beads与细胞裂解液在4 ℃条件下继续孵育2 h.随后在4 ℃、1 000 r/min 条件下离心3 min，并用RIPA 裂解液洗3次.之后取沉淀，加入20 μL 的2×loading buffer，95 ℃下煮样5 min，4 ℃、14 000 r/min 条件下离心2 min，取上清液进行SDS-PAGE 和Western blot 检测.

1.2.3 细胞免疫荧光染色

用体积分数为3%的福尔马林和质量分数为2%的蔗糖的PBS 溶液在室温下处理细胞15 min，PBS 洗3 次后用浓度为0.1 mol/L 甘氨酸的PBS 溶液浸泡细胞5 min.用体积分数为10%的血清和质量分数为0.4%的Triton X-100 的PBS 溶液封闭细胞30 min.二抗为FITC 或Texas Red 标记的羊源二抗，采用DAPI 染色DNA.一抗（53BP1 抗血清）室温孵育2 h，二抗室温避光孵育1 h，DAPI 室温避光孵育3 min.

1.2.4 免疫组化染色检测

应用通用型免疫组化试剂盒进行组织标本免疫组化染色实验.首先对组织芯片进行脱蜡处理，然后进行抗原修复，接着用山羊血清对组织芯片进行封闭处理30min.倒干液体，加入适量53BP1 抗血清（与PBST 按照体积比1 ∶500 稀释）于组织切片上，室温孵育1 h.PBS洗3 次，每次2 min，加入HRP 偶联的二抗（与PBST按照体积比1 ∶500 稀释）室温孵育20 min.PBS 洗3 次，每次2 min，加入DAB 显色液.镜下观察染色情况，之后用水冲洗.对组织切片进行梯度脱水，即将载玻片依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、二甲苯中，每种试剂中放置5 min，最后封片.

1.2.5 ONCOMINE数据库检索

登录ONCOMINE网站，在搜索栏（search）输入53BP1，限制搜索条件，检索53BP1 在结肠癌组织中的表达.

1.2.6 统计学处理

采用SPSS17.0 软件进行统计分析，通过卡方检验，以P<0.05 为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 53BP1的抗血清验证

将化学合成的53BP1 抗原多肽与KLH 偶联，对新西兰大白兔进行皮下注射.免疫5 次后抽血，离心之后可得到抗血清.收集U2-OS 细胞进行免疫共沉淀实验检测该抗血清的特异性，结果如图1 所示.由图1 可以看出，在53BP1 抗血清IP 泳道和1/10 全细胞裂解液泳道约220×103处检测到了条带.

图1 蛋白免疫沉淀实验对53BP1 抗血清结合内源53BP1 分子的鉴定Fig.1 Identification of endogenous 53BP1 protein molecules combined with 53BP1 antibody by immunoprecipitation experiment

通过免疫荧光染色实验，对体外培养的HeLa 细胞进行53BP1 和DNA 的染色，在荧光显微镜下进行观察，结果如图2 所示.由图2 可以看出，与DNA 染色结果进行对比发现，53BP1 绝大部分定位在间期细胞的细胞核位置，少数游离于细胞核外.

图2 53BP1 抗血清的细胞免疫荧光实验鉴定（10×）Fig.2 Appraisal 53BP1 antibody by immunofluorescence experiment（10×）

应用免疫组织化学染色技术，用53BP1 抗血清和苏木精分别对同一结肠癌组织的2 张切片进行染色，结果如图3 所示.比较53BP1 抗血清染色和苏木精染色结果可以看出，53BP1 抗血清在结肠癌组织中的着色位置与苏木精的着色位置基本一致，主要定位于组织中的细胞核.

图3 53BP1 抗血清的免疫组织化学染色鉴定Fig.3 Appraisal 53BP1 antibody by immunohistochemical staining

以上结果表明，本研究制备的53BP1 抗血清具有特异性，可以应用于临床病理组织的免疫组织化学染色.

2.2 53BP1表达与结肠癌临床病理因素的关系

应用上述53BP1 抗血清对结肠癌组织芯片进行免疫组织化学染色，结果如图4 所示.

图4 53BP1 抗血清的免疫组织化学染色Fig.4 Immunohistochemical staining with 53BP1 antibody

通过对图4 中组织着色深浅的分析，比较53BP1在31 个病例中癌组织和癌旁组织的表达，结果如图5 所示.由图5 可以看出，在结肠癌组织中，53BP1的表达量高于癌旁组织，通过无重复双因素分析，差异具有统计学意义（P ＜0.01）.

图5 53BP1 在结肠癌组织与癌旁组织中的表达Fig.5 Expression of 53BP1 in colorectal cancer and tissues adjacent to cancer

利用上述结肠癌组织芯片的53BP1 染色结果，分析它在不同TNM 分期的癌组织与癌旁组织中的表达差异，结果如图6 所示.由图6 可以看出，在所有结肠癌TNM 分期中，癌组织中的53BP1表达量均高于癌旁组织中的表达量，其中，Ⅱ期结肠癌患者癌组织与癌旁组织中表达量的差异具有统计学意义（P ＜0.05）.Ⅰ期结肠癌组织中的53BP1 也呈现高表达，但癌组织与癌旁组织中的表达量差异不具有统计学意义（P ＞0.05）.

图6 53BP1 在不同TNM 分期的结肠癌组织与癌旁组织中的表达Fig.6 Expression of 53BP1 in colorectal cancer and tissues adjacent to cancer with different TNM stages

统计不同结肠癌临床病理因素中53BP1的表达量，结果如表1 所示.由表1 可以看出，结肠癌组织中53BP1的高表达与肿瘤大小和TNM 分期密切相关：当肿瘤组织≥4 cm 时，17 例结肠癌患者中有15例患者的53BP1 高表达，显著高于肿瘤组织＜4 cm 患者的表达比例； 在TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期的结肠癌患者中，16 例患者中有14 例患者的53BP1 高表达，显著高于Ⅲ-Ⅳ期患者的表达比例.53BP1的高表达与患者的年龄、性别、分级、肿瘤是否转移等相关性不显著.

表1 53BP1 蛋白分子与结肠癌临床病理因素的关系Tab.1 Relationship between 53BP1 and colorectal cancer tissue in clinical pathological features

2.3 基于ONCOMINE数据库分析53BP1 在结肠癌中的表达

检索ONCOMINE数据库中53BP1在结肠癌中的表达，结果如图7 所示.由图7 可以看出，53BP1 在结肠癌组织中的表达水平明显高于正常组织.

图7 ONCOMINE数据库检索的53BP1 在结肠癌中的表达Fig.7 Expression of 53BP1 in colorectal cancer in the ONCOMINE database

3 讨论与结论

53BP1 是DNA 双链损伤（DSB）修复途径中一个重要的蛋白分子，能在DSB 发生后第一时间被磷酸化且聚集在DNA 损伤处，被公认为DNA 双链损伤的标志分子之一[14].若53BP1 功能异常或者表达量升高，则会阻止DSB 修复，进而导致细胞基因组不稳定，使细胞发生死亡或者癌变.此外，53BP1 还具有其他生理功能，如调控细胞周期等[15].因此，该蛋白分子可作为一个重要的潜在分子标志物，用于检测肿瘤的发生发展.

本研究设计了53BP1 抗原多肽，通过免疫新西兰大白兔制备抗53BP1 血清，将该抗血清应用于免疫共沉淀实验后，在220×103处检测到条带，说明该抗血清能特异性结合53BP1 蛋白分子，辅以细胞免疫荧光实验和免疫组织化学染色实验的鉴定.将上述结果与其他研究对比后，确定了该抗体的特异性，证明该抗体可以应用于结肠癌组织芯片的免疫组织化学染色实验[12-15].对结肠癌组织芯片的免疫组织化学染色结果进行分析，并结合ONCOMINE数据库检索结果得出，53BP1 在结肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，且与结肠癌组织大小和TNM 分期有关.在肿瘤组织≥4 cm 的病例中癌组织的53BP1表达量比癌旁组织高；同时，在结肠癌Ⅱ期中，癌组织的53BP1表达水平明显高于癌旁组织.因此，53BP1 在早期结肠癌组织中高表达，可能会促进肿瘤的生长.当肿瘤发展到Ⅱ期时，53BP1的高表达可能会促进肿瘤向周围组织浸润.但当结肠癌进入Ⅲ期、Ⅳ期时，出现淋巴结转移和/或远端转移，癌组织和癌旁组织中的53BP1表达无显著差异，预示53BP1 可能与结肠癌的转移没有相关性.本研究结果表明53BP1 是一个潜在的结肠癌早期分子标志物，这些研究为53BP1 应用于临床结肠癌的早期诊断提供了实验依据.