棉铃虫膨胀线粒体基因组的鉴定与分析

张屾 谷少华 李显春

摘要以已公布的棉铃虫线粒体DNA序列对来自4头棉铃虫雄蛹的DNA的三代测序数据进行筛选，获得了11条与线粒体DNA有同源性的三代read序列，并根据其中的read 66003鉴定出了一种膨胀的线粒体基因组。该线粒体基因组大小为27 113 bp，其保守区域包含13个蛋白编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因以及1个AT富集区，与已公布的棉铃虫线粒体基因组的结构相似。膨胀区域位于cox1基因编码区内部，大小为11 467 bp，经预测含有一个完整的真核基因（依赖ATP的RNA解旋酶）以及多种转座元件的片段，但与线粒体DNA无同源性，也无I类或Ⅱ类内含子存在的证据。对田间和室内棉铃虫DNA样品的PCR扩增未能检测到膨胀线粒体基因组的存在。以上结果表明膨胀片段可能是细胞核DNA序列通过偶然的水平转移事件而整合到线粒体基因组中的，且该种膨胀方式的发生概率极低。本文报道的膨胀线粒体基因组为日后动物线粒体基因组学的研究提示了一种独特的变异方式。

关键词棉铃虫;线粒体基因组;膨胀;RNA解旋酶;转座子

中图分类号：S 435.622

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018223

线粒体是真核细胞中一种最基本的细胞器，一般认为其起源于细菌在真核细胞中的内共生作用[1]，且保留了一套独立于细胞核基因组之外的遗传系统，能够进行自我复制和表达。在植物和动物中，尽管线粒体承担的生物学功能相似，但其基因组却向两个极端对立的方向演化：植物线粒体基因组复杂、庞大，变异程度较大，富含大量非编码序列和内含子;而动物的线粒体基因组较为保守，基因排布紧凑，非编码区含量较少，一般不含内含子[2]。动物线粒体基因组大小通常在15～20 kb之间，包含13个蛋白编码基因、22个转运RNA（tRNA）基因、2个核糖体RNA（rRNA）基因和1个AT富集区（控制区）[3]。尽管动物线粒体基因组在基因组成和结构上的保守性较高，但变异事件亦会偶尔发生，主要表现为基因的复制或缺失、基因重排以及非编码区的扩张或收缩等方式。

基因的复制或缺失是动物中相对常见的线粒体基因组变异方式。例如，某些腔肠动物及箭虫的线粒体基因组中缺失了几个乃至全部的tRNA基因[45]，在蛛形纲部分物种和瘿蚊类昆虫的线粒体基因组中则存在tRNA缩短的现象[67]，而基因复制现象在螨、蓟马乃至脊椎动物的线粒体基因组中均有发现[810]。

进一步地，线粒体基因复制和缺失事件的积累可能导致基因重排现象的产生[11]。邱忠营[12]对153种直翅目昆虫的线粒体基因组进行了比较基因组学分析，总结了其中12个物种的基因重排模式，其重排事件发生的概率较低，且多数为tRNA基因位置的颠换。线粒体基因重排极端化的一种表现是线粒体的片段化。鞭毛虫、水母和虱目等的线粒体中均发现了片段化的现象，最典型的例子是体虱Pediculus humanus，其线粒体基因组由18个微型染色体（minichromosome）组成，每个染色体长3～4 kb，携带1～3个基因及一个控制区[1315]。

线粒体基因组非编码区的变异主要源自内含子或重复元件的复制或丢失。线粒体基因组中的内含子分为Ⅰ类内含子（group Ⅰ intron）和Ⅱ类内含子（group Ⅱ intron）两类，二者不同于真核细胞核基因组内的剪接体内含子，它们具备核酶的催化功能，能够在不依赖剪接体的情况下完成自我剪接[1618]。Ⅰ类内含子多见于真菌线粒体，而Ⅱ类内含子则为植物线粒体基因组内含子的主要形式。内含子在动物线粒体中较为罕见，目前仅在海葵、珊瑚等低等后生动物中有报道。Beagley等[4，19]在绣球海葵Metridium senile线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cox1）和NADH脱氢酶亚基5（ND5）编码基因内部分别发现了一个Ⅰ类内含子，其中前者能够自我成环并编码一个核酸内切酶，而后者内部则含有编码ND1和ND3的基因，且内含子自我剪接后二者能够以双顺反子的形式进行转录。进一步的研究表明，线粒体ND5内含子在六射珊瑚纲的物种内普遍存在，且其内部的蛋白编码基因复制数目在演化中逐步增加[20]。

相较于内含子，控制区或其他重复序列的变异在动物线粒體基因组中更常见且形式更丰富。Tang等[21]在寄生线虫Thaumamermis cosgrovei中鉴定出两种线粒体基因型，其差异源于基因或非编码区的变异。软体动物线粒体基因组的非编码序列的扩张最为普遍，且个体间差异明显。深海扇贝Placopecten magellanicus线粒体基因组的大小从30.7 kb至40.7 kb不等，基因组内有3个位点存在结构变异，每个位点至少存在6种不同形式的重复元件，导致了线粒体基因组在个体间的巨大变异[2224]。类似地，在另一种扇贝Pecten maximus的线粒体基因组中存在一类拷贝数可变的长约1.6 kb的重复元件，其重复次数的不同致使基因组大小在20.0 kb到25.8 kb之间波动[25]。赤贝Scapharca broughtonii的线粒体基因组大小约为50 kb，是后生动物中已知最长的线粒体DNA，其基因组内含有一个串联重复单元以及一个可复制的非编码区，二者的变异是基因组扩张的原因[26]。Raimond等[27]利用RFLP技术测定了鼠妇Armadillidium vulgare的线粒体基因组大小（20～42 kb），结合电镜观察提出一种膨胀的线粒体基因组的存在形式：约14 kb的线粒体DNA单体发生复制和重排形成3个单体，其中一个以线性形式存在，另外两个则连接成环。Boyce等[28]在3种象甲Pissodes spp.的线粒体DNA中发现了扩张的AT富集区（9～13 kb），同时在其侧翼还存在数目不等的重复元件，这成为该属昆虫线粒体基因组变异的原因。综上所述，动物线粒体在基因组成和结构上相对保守，变异事件形式有限、发生概率较小，其中基因重排和内含子插入事件多为可遗传的，已成为物种固定的遗传属性，而重复元件的变异通常存在多样性和随机性，在物种内个体间存在差异。

棉铃虫Helicoverpa armigera属鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是世界范围内的一种重要农业害虫，其线粒体基因组已在2010年公布，总长度为15 347 bp，具备典型的动物线粒体基因组结构[29]。本文利用三代DNA测序技术，鉴定出一条异常的棉铃虫线粒体DNA序列，其cox1基因内部插入了一段11 467 bp的疑似核基因组的片段，导致线粒体基因组显著膨胀，为动物线粒体基因组学的研究提示了一种特殊的变异方式。

1材料与方法

1.1样品及数据来源

棉铃虫线粒体基因组序列获取自二代和三代全基因组DNA测序read。DNA样品来自4头蛹期的棉铃虫，对其进行全基因组DNA抽提和建库测序。二代测序平台为Illumina Hiseq 2000，三代测序平台为PacBio SMART RS Ⅱ。原始测序数据下机后经过质量控制和融合，以二代数据对三代数据进行校正，校正后的数据用于筛选线粒体相关的read序列。

1.2线粒体基因组的注释

线粒体基因组首先以在线工具MFannot和RNAweasel[16]（http：∥megasun.bch.umontreal.ca/RNAweasel/）进行蛋白编码基因、rRNA基因以及tRNA基因的预测，随后从Yin等[29]的报道中提取注释信息，将之补充并整合到上述预测结果中，得到最终的线粒体注释结果。线粒体基因组结构图的绘制使用在线工具CGView Server V 1.0[30]（http：∥stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/）。

1.3线粒体膨胀区域的分析

膨胀区域的分析通过BLASTn和BLASTx分别在NCBI的Nucleotide collection（Nt）和Nonredundent（Nr）数据库中进行检索。基因结构的作图使用在线工具Gene Structure Display Server 2.0[31]（http：∥gsds.cbi.pku.edu.cn/）。转座元件的预测使用Repbase数据库中的在线工具CENSOR[32]（https：∥www.girinst.org/censor/）。I 类或Ⅱ类内含子的预测采用RNAweasel。

2结果与分析

2.1棉铃虫膨胀线粒体DNA的鉴定

以已公布的棉铃虫线粒体基因组序列（GenBank登录号GU188273）作为query序列，检索校正后的三代read，从中筛选出11条与线粒体DNA有同源性的read序列（表1）。序列比对结果显示，11条read中有8条对query的覆盖度较低（<60%），而另外3条超过90%，其中，仅有read 66003完整覆盖线粒体基因组且首尾存在重叠，由此得到了一条膨胀的环状线粒体DNA序列用于后续分析。

2.2棉铃虫膨胀线粒体基因组的注释

膨胀的棉铃虫线粒体基因组大小为27 113 bp，其基因组结构如图1所示。与已公布的棉铃虫线粒体基因组的比对结果显示，膨胀线粒体基因组可分为保守区域和膨胀区域两部分。保守区域中二者核苷酸序列相似度达到97%。通过注释，在保守区域鉴定出了13个蛋白编码基因（cox1，cox2，cox3，cob，nad1，nad2，nad3，nad4，nad4L，nad5，nad6，atp6，atp8）、2个rRNA基因（rnaL，rnaS）、22个tRNA基因（亮氨酸tRNA和丝氨酸tRNA分别有2个拷贝，其余18种氨基酸分别对应1个tRNA）以及1个AT富集区。其基因组成和排布方式与已公布的棉铃虫線粒体基因组基本一致，不同之处在于cox1基因被打断为两部分且缺失了约23 bp的编码序列。膨胀区域是一个连续的、长度为11 467 bp的片段，与正常线粒体无同源性，存在于cox1基因编码区之中。

2.3棉铃虫线粒体基因组膨胀区域的分析

蛋白编码基因检索的结果显示，膨胀区域内包含一个依赖ATP的RNA解旋酶基因（ATPdependent RNA helicase，GenBank登录号XM_021342945）。该基因具有真核基因的结构，编码区位于轻链的3 931-10 784 bp区间，包含5个外显子，基因结构图如图2所示。

NCBI Nt数据库的检索结果显示，与膨胀区域匹配度最高的subject为棉铃虫细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）序列（GenBank登录号FO082297）。进一步地，使用Repbase预测膨胀区域转座元件，结果如表2所示。其中较完整的一个元件注释为非长末端重复反转录转座子（Non long terminal repeat retrotransposable element，NonLTR/RTE）RTE5，在基因组中分为4个片段，总长度约2 800 bp，其主要部分位于膨胀区域的6 500-8 800 bp之间，即RNA解旋酶基因第三个内含子内部。其他转座元件还涉及多种DNA转座子、LTR反转录转座子以及散布重复序列等，但均不超过1 kb，不具备完整的转座子结构。此外，内含子预测的结果显示，膨胀区域内既不含有I 类/Ⅱ类内含子的保守结构，也没有编码逆转录酶或核酸内切酶的基因，无法找到内含子存在的证据。

3讨论

本文从棉铃虫全基因组三代测序原始数据中，筛选得到了与线粒体相关的序列。其中，read 99261和read 119177的read覆盖度为100%，表明二者可能是正常线粒体DNA的片段;read 66003完整覆盖subject，且在二代测序数据的辅助下能拼接成环，因此我们借助该read鉴定出了膨胀的棉铃虫线粒体基因组;而其余read对subject的覆盖度较低或存在片段倒位（表1），由于原始数据未经过拼接组装，不存在拼接错误，因此我们推测这些序列并非是线粒体源的DNA，而是包含线粒体假基因的核基因组序列。线粒体基因组向核基因组迁移的现象广泛存在。在动物中，线粒体基因通常以假基因形式存在于核基因组中，分布形式多变[3334]，其中昆虫基因组中的线粒体假基因已在蚱蜢、蚜虫、天牛等类别的物种中得到研究[3537]。植物中线粒体DNA迁入核基因组的事件比动物更为普遍，核基因组能获得线粒体基因并保留其功能[38]，且线粒体基因组能以大片段乃至完整形式插入核基因组[39]。在本研究中，线粒体相关read的鉴定暗示棉铃虫核基因组中可能存在诸多的线粒体假基因，且假基因与真基因的相似度较高，但假基因的种类、拷贝数以及分布方式等问题尚未明确，仍有待进一步研究。Song等[40]的研究表明，细胞核基因组中的线粒体假基因会干扰DNA条形码鉴定技术的准确性，这也提示我们未来使用DNA条形码定量检测棉铃虫种群时需注意排除线粒体假基因的干扰。

后生动物线粒体基因组通常编码37个基因，长度一般不超过20 kb，非编码序列含量很低。棉铃虫线粒体基因组前人已有报道[29]，符合动物线粒体基因组的这些保守特征。本文通过高通量测序发现了一种不同于该报道的、异常膨胀的棉铃虫线粒体基因组，其大小达到27 113 bp。与已公布的序列相比，基因组内部发生了显著的膨胀，膨胀原因主要是cox1基因编码区中间插入了一段11 467 bp的序列。线粒体基因组的膨胀主要通过基因复制或非编码区扩张的方式实现。为此，我们分析了膨胀序列的来源以及该区域内编码基因、重复元件或内含子存在的可能性。如2.3所述，该片段在NCBI Nt数据库中能够匹配到棉铃虫BAC序列，却与线粒体DNA无任何匹配，表明其并非线粒体基因组自身的复制或扩张，而更可能来源于核基因组。通过功能基因的注释，发现膨胀区域包含一个完整的核基因组蛋白编码基因（依赖ATP的RNA解旋酶），且具有外显子内含子的真核基因结构。这进一步表明膨胀片段可能是一段核基因组序列通过水平转移被整合进线粒体基因组的产物。

I 类内含子和Ⅱ类内含子不同于核基因组内的剪接体内含子，二者不依赖复杂的剪接体即可完成自我剪接，后者通常还具备逆转录酶、成熟酶或核酸内切酶的编码区[16]。本研究中，利用核酸内切酶、逆转录酶保守结构域以及内含子预测工具均未在膨胀区域发现内含子存在的证据，这表明棉铃虫线粒体基因组的膨胀并非由内含子插入导致。我们进一步使用Repbase预测了膨胀线粒体基因组内转座元件存在的可能性。结果表明，该区域内存在一个较完整的NonLTR类反转录转座子以及诸多转座元件的片段。这些转座子序列大多不完整，且呈分散或嵌套分布，因此我们推测膨胀片段的祖先序列经历了多次转座事件，多数转座子结构被破坏，仅残留部分痕迹，而线粒体基因组中该膨胀部分的插入则可能是在上述转座事件后发生的一次细胞核DNA水平转移事件。

在植物中，核内DNA序列、尤其是转座元件整合进入线粒体基因组的现象较为普遍[39]，但在动物线粒体基因组中此类变异事件较为罕见，且对于简单、紧凑的线粒体基因组，转座子通常是有害的，在演化过程中易受净化选择（purifying selection）作用而被清除。针对本文中鉴定得到的棉铃虫膨胀线粒体基因组，我们曾尝试在室内及田间收集的数十个棉铃虫DNA样品中克隆该膨胀区域，但均未发现目的片段整合到线粒体基因组的证据。该膨胀的线粒体基因组序列是直接由DNA测序read得到的，不会掺入拼接错误，因此可以保证其存在的真实性，而其克隆证据的缺失一方面可能是因为膨胀序列的保守性较低，存在诸多变异形式，另一方面，更大的可能性在于此种线粒体膨胀事件发生的概率极低，且其破坏了cox1基因的编码区，对个体生存是不利的，很难被遗传下去，只是发生在体细胞的一种偶然突变。尽管如此，本文报道的棉铃虫线粒体基因组的膨胀，仍可为日后的研究提示一种特殊的线粒体基因组变异方式。

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（責任编辑：杨明丽）