苏云金芽胞杆菌cry8Ea启动子区orf1片段缺失增强启动子活性

崔婷婷 杜立新 彭琦

摘要本文分别构建了cry8E基因上游的启动子（Porf18E）和其上游缺失orf1基因的启动子（PΔorf18E）融合lacZ基因的表达载体，通过β半乳糖苷酶活性的分析，发现PΔorf18E的转录活性高于Porf18E。分别用PΔorf18E和Porf18E指导cry1Ac基因的表达，通过光学显微镜观察，发现两个启动子指导表达的Cry1Ac蛋白均可形成双锥形晶体;通过总蛋白定量分析发现，缺失orf1基因的启动子（PΔorf18E）指导的Cry1Ac蛋白表达量高于Porf18E启动子指导的Cry1Ac蛋白表达量;生物活性测定表明：PΔorf18E指导的Cry1Ac晶体蛋白对小菜蛾Plutella xylostella具有杀虫活性，高于Porf18E指导的Cry1Ac晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性。本文获得的强活性的启动子PΔorf18E是目前已报道的转录活性最高的cry基因启动子，该启动子为Cry蛋白的表达和遗传工程菌株构建提供了重要元件。

关键词苏云金芽胞杆菌;cry基因启动子;转录活性;Cry晶体蛋白;晶体蛋白表达

中图分类号：S 476.11

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018138

苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis，简称Bt，是革兰氏阳性细菌，属于蜡样芽胞杆菌菌族Bacillus cereus group，其在芽胞形成的同时能够产生对多种农林害虫有杀虫活性的伴胞晶体，主要由cry或cyt基因编码。因其对人畜无害、对环境友好等特性，Bt已被商业化应用，成为世界上应用最广的微生物杀虫剂[1]。但是Bt杀虫剂在田间应用过程中，Cry蛋白存在持效期短、受紫外照射等环境因素影响容易降解等缺点，因此提高Cry蛋白的产量和稳定性成为Bt遗传改良的有效策略。目前已报道，cry8E基因的启动子指导表达的Cry1Ac蛋白产量高于野生菌株HD73产生的Cry1Ac蛋白[2]。高活性的非cry基因的启动子也已成功表达Cry蛋白，如编码芽胞外壁基层蛋白的exsY基因的启动子PexsY可正确指导Cry1Ac蛋白的表达[3];最新的研究表明，Bt HD73_5014基因的启动子可以高效地指导表达Cry1Ac蛋白，其表达的蛋白产量与cry8E启动子指导表达的Cry1Ac蛋白产量相当[4]。因此，发掘强活性的启动子指导Cry蛋白的表达是一条重要途径。

cry8E基因和上游基因orf1以操纵子形式成为一个转录单元，分别受σH和σE调控[5]，cry8E基因的启动子Porf1cry8E是目前报道的转录活性最强的cry基因启动子[4，6]。本研究在此基础上，分析了缺失orf1基因的启动子PΔorf18E的活性;用PΔorf18E启动子指导表达Cry1Ac晶体蛋白并检测其杀虫活性。PΔorf18E启动子为Cry蛋白的表达和遗传工程菌株构建提供了重要元件。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株、质粒和培养基

本试验中所用菌株与质粒见表1。大肠杆菌Escherichia coli的培养使用LB培养基（胰蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，NaCl 1.0%，pH 7.2）。Bt的培养使用LB培养基和SSM培养基[7]。Bt在30℃、220 r/min条件下培养;E. coli在37℃、220 r/min条件下培养，氨苄青霉素使用终浓度为100 μg/mL，红霉素使用终浓度为5 μg/mL。

1.1.2主要试剂

TaqMix DNA聚合酶购自BioMed;限制性内切酶、PrimeStar、T4 DNA连接酶、DH5α感受态、Solution I购自大连宝生物有限公司;胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自Axygen;无缝克隆试剂盒（Seamless Assembly Cloning Kit）购自中美泰和生物技术有限公司。

1.1.3引物合成及序列测定

根据Bt 185菌株[8]和HD73菌株[10]的基因组序列设计引物，引物合成由上海生工生物工程公司北京合成部完成，引物名称及序列见表2。序列测定由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1） 下划线表示酶切位点。

Restriction enzyme sites are underlined.

1.2Porf18E和PΔorf18E启动子融合lacZ基因表達载体的构建

以Bt185基因组[8]为模板，以Porf15/P8E3为引物扩增含有orf1的启动子、orf1基因和cry8E基因启动子的片段Porf18E（1 352 bp），PCR产物纯化后经PstⅠ和BamHⅠ双酶切并连接至含有lacZ报告基因的pHT30418Z载体Pst Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切片段上，转化E. coli TG1菌株，获得重组质粒pHTPorf18E;以Bt185基因组为模板，分别以Porf15/Porf13和P8E5/P8E3为引物扩增orf1的启动子（Porf1，559 bp）和cry8E基因的启动子（Pcry8E，280 bp），PCR产物纯化后，应用无缝克隆试剂盒将Porf1和Pcry8E片段连接至含有lacZ报告基因的pHT30418Z载体Pst Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切片段上，转化E. coli TG1菌株，获得缺失orf1基因的重组质粒pHTPΔorf18E。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定，转化至E. coli ET菌株使质粒去甲基化，然后将重组质粒电击转化至Bt HD73菌株，获得菌株HD（Porf18E18Z）和HD（PΔorf18E18Z）。

1.3β半乳糖苷酶活性分析

分别取500 μL活化过夜的HD（Porf18E18Z）和HD（PΔorf18E18Z）菌株转接到50 mL SSM培养基中，30℃，220 r/min培养至T0时期（T0为对数生长期结束时间，Tn为T0后第n小时），每隔1 h取样1次，每次2 mL，12 000 r/min离心，弃上清，沉淀于-40℃保存备用。β半乳糖苷酶活性测定方法参考文献[11]，试验至少重复3次。

1.4Porf18E和PΔorf18E启动子指导Cry1Ac表达载体的构建

分别以pHTPorf18E和pHTPΔorf18E质粒为模板，以Porf15/P8E3为引物，扩增Porf18E和PΔorf18E片段;以BtHD73基因组为模板，以1ACF和1ACR为引物扩增cry1Ac基因（3 537 bp），PCR产物纯化后，应用无缝克隆试剂盒，分别将Porf18E和cry1Ac两个片段、PΔorf18E和cry1Ac两个片段连接至经过Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切的pHT304载体上，转化E. coli TG1菌株，获得重组质粒pHTPorf18E1Ac和pHTPΔorf18E1Ac。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定，转化至E. coli ET菌株使质粒去甲基化，然后将重组质粒电击转化至Bt HD73-无晶体突变菌株中，获得菌株HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）。

1.5显微镜观察

分别取500 μL过夜活化的HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌液转接至50 mL SSM培养基，30℃，220 r/min，培养至T20、T22和T24，取1 mL菌液，12 000 r/min离心1 min，弃上清，沉淀用1 mL的无菌水清洗1次，12 000 r/min离心1 min，弃上清，沉淀用60 μL的水悬浮，吸取1 μL的样品置于载玻片上，上面覆盖盖玻片在100×的油镜（OLYMPUS，BX61）下观察菌体形态。

1.6菌体总蛋白定量

分别取500 μL过夜活化的HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌液转接至50 mL SSM培养基，30℃，220 r/min，培养到细胞裂解（T24），12 000 r/min离心1 min收集菌体，用水重悬，加入石英砂破碎，混合均匀;样品与5 ×loading buffer混匀，沸水浴中10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清用 Pierce660 nm Protein Assay Kit 进行总蛋白的定量，方法参见Pierce 660 nm Protein Assay Kit 说明书。取总蛋白量一致的样品SDSPAGE（sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis）检测Cry1Ac蛋白，并利用Image J软件分析Cry1Ac蛋白的表达量[2]。

1.7生物活性测定

以小菜蛾Plutella xylostella为试虫，用于生物活性测定的菌株为HD-（Porf18E1Ac）、HD-（PΔorf18E1Ac）、HD73和HD73-。菌株在SSM培养基中培养至T24时期，将菌液冻干，取相同生物量的4株菌的冻干粉，用灭菌水稀释成相同的浓度，分别为：1.25、2.5、5、10、20、40和80 μg/mL;将上述不同浓度的菌液均匀地涂抹于直径为6 cm的卷心菜叶上，晾干后，置于9 cm的培养皿中;每个培养皿中接种30头体型相当的小菜蛾2龄幼虫。48 h后计算幼虫成活率和LC50。数据独立重复3次。

2结果与分析

2.1Porf18E和PΔorf18E启动子活性分析

cry8E基因上游的全长启动子Porf18E和缺失orf1基因的启动子PΔorf18E融合lacZ基因的表达菌株HD（Porf18E18Z）和HD（PΔorf18E18Z）的构建流程见图1a，β半乳糖苷酶活性测定表明，在T0-T3时期，HD（Porf18E18Z）和HD（PΔorf18E18Z）菌株的转录活性没有明显区别（图1b），从T4开始到T12，HD（PΔorf18E18Z）菌株的活性明显高于HD（Porf18E18Z）菌株，说明orf1基因的缺失导致cry8E基因启动子的转录活性上升。

2.2Porf18E和PΔorf18E指导Cry1Ac表达菌株的获得

缺失orf1基因的启动子转录活性PΔorf18E高于全长的Porf18E启动子转录活性，为了比较两个启动子指导的Cry蛋白的表达量，构建了Porf18E和PΔorf18E指导Cry1Ac表达载体（详见方法1.4），構建流程见图2a，将表达载体转入HD73-无晶体突变体株，获得用于表达Cry1Ac蛋白的菌株HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）。在cry1Ac基因内部设计3′端引物（8E1AcR），在Porf1片段上游设计5′端引物（8E1AcR），经PCR鉴定（图2b），以HD-（Porf18E1Ac）菌株为模板，扩增得到1 104 bp的片段;以HD-（PΔorf18E1Ac）菌株为模板，扩增得到681 bp的片段，两个PCR产物大小相差423 bp，与缺失的orf1基因的大小一致，说明菌株构建正确。

2.3Cry1Ac晶体形态学观察

在光学显微镜下观察HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌株产生的Cry1Ac晶体蛋白形态，以野生型HD73和无晶体突变株HD73-作为对照，结果（图3）表明，在T20、T22、T24这3个时期，HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌株均可以正常表达Cry1Ac晶体蛋白，与野生型HD73一样，形成双锥形晶体蛋白，而HD73-菌株无晶体蛋白产生。说明Porf18E和PΔorf18E均可指导表达Cry1Ac蛋白。

2.4菌体Cry1Ac晶体蛋白产量分析

为了比较Porf18E和PΔorf18E指导表达的Cry1Ac蛋白产量，以HD73为阳性对照，HD73-为阴性对照，应用Pierce660 nm Protein Assay Kit对HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌株进行总蛋白定量，取相同量的总蛋白进行SDSPAGE检测，结果表明（图4），HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌株均可表达出约130 kD的Cry1Ac蛋白，而HD73-无晶体突变体无蛋白表达;利用Image J软件分析Cry1Ac蛋白的表达量，发现在总蛋白量相同的条件下，HD-（PΔorf18E1Ac）菌株表达的Cry1Ac的量约为HD-（Porf18E1Ac）菌株的1.5倍，这与PΔorf18E和Porf18E启动子的酶活数据趋势相一致（图1b），说明强活性的PΔorf18E启动子，指导表达的Cry1Ac蛋白的产量也提高。

2.5生物活性分析

为了比较Porf18E和PΔorf18E指导表达的Cry1Ac蛋白的活性，选取相同生物量的HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌株对小菜蛾Plutella xylostella幼虫进行生物活性测定，以HD73为阳性对照，HD73-为阴性对照。接种幼虫48 h后计算成活率，并计算LC50，结果表明（表3）HD-（PΔorf18E1Ac）菌株对小菜蛾的杀虫活性最高，说明缺失orf1基因的启动子PΔorf18E指导表达Cry1Ac蛋白的菌株具有较高的杀虫活性，这与启动子酶活结果（图1b）和Cry1Ac蛋白表达量结果（图4）一致。

3讨论

前期研究中，通过比较不同转录调控机制的cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因的启动子的转录活性，发现转录活性由高到低依次为：Pcry8E>P1Ac>Pcry4A>Pcry3A[2，6，12]。cry8E基因的启动子Pcry8E可以正确地指导Cry1Ac的表达，并且可以形成双锥形晶体，同时对小菜蛾有杀虫活性[2，12]。本研究发现，缺失orf1基因的启动子PΔorf18E的转录活性高于已报道的最高活性的cry基因启动子Porf1cry8E，因此PΔorf18E启动子是目前发现的最高活性的cry基因的启动子。PΔorf18E可正确指导表达Cry1Ac蛋白，并具有杀虫活性，该启动子可用于构建高效表达载体，从而实现杀虫蛋白的高效表达，在研制更为高效广谱的苏云金芽胞杆菌工程菌中发挥重要的作用。

苏云金芽胞杆菌在表达大量的杀虫晶体蛋白的同时还表达一些小分子量蛋白质，它们自身不具有杀虫活性，但可以影响某些杀虫晶体蛋白的表达和晶体形成。这些cry基因通常与这些小分子量蛋白基因组成转录单元共同转录[13]。这些小分子量蛋白本身没有杀虫活性，不是伴胞晶体的主要成分，但对某些杀虫晶体蛋白的正常表达或晶体形成有促进作用，甚至是必需的，因此被称为辅助蛋白（accessory protein）。目前已知的辅助蛋白主要有5个，即cry11Aa操纵子中的P19和P20[14];cry2Aa操纵子中的ORF1和ORF2[15];以及cry19A 转录单元下游orf2 编码的60 kD蛋白（ORF260k）[13]。P19对cry11A基因的表达略有帮助;P20作为分子伴侣能够促进多种Bt杀虫晶体蛋白的产量和/或晶体形成[16];而ORF1 对晶体蛋白产量或蛋白晶体化的影响尚不明确。ORF2和ORF260k蛋白对于Cry2A 和Cry19A的晶体形成是必需的[13，17]。此外，cry6Aa2基因下游的ORF2蛋白对其表达存在负调控作用，但作用机制尚不明确[18]。本研究中的cry8E操纵子中orf1基因编码的ORF1氨基酸序列，与cry9Ec1基因操纵子中的ORF1相似性为66%;与cry9Ca1基因操纵子中的ORF1相似性为65%;与cry2A基因操纵子中的ORF1具有64%的相似性;与cry11A操纵子中的第一个orf—P19有40%的相似性;与Cry18A操纵子中ORF1具有39%的相似性。转录调控研究表明，orf1基因缺失导致cry8E基因启动子PΔorf18E的转录活性上升，同时可以提高Cry1Ac蛋白的表达量，这些结果与前人报道的关于辅助蛋白p19基因和orf1基因的功能是不同的，说明cry8E操纵子中的ORF1存在一种新的功能，可能对cry8E基因的转录存在调控功能，但其作用机制还有待进一步研究。

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（責任编辑：田喆）