病死鸡尸体发酵堆肥中蛋白酶分解菌的分离鉴定及发酵工艺的研究

郭芳先 肖发沂 冯传明 陈永科 刘镇

摘  要：从鸡场病死鸡自然发酵堆肥中取样，分离筛选得到一株产蛋白酶活性高（揺瓶培养基酶活为2000U/ml）的菌株，经过鉴定，该菌株为解淀粉芽孢杆菌。本文通过不断优化该菌株的产芽孢培养基及其发酵工艺，最终确定了该菌在100～2000L发酵罐的发酵工艺，放罐芽孢数可达3.1×1010CFU/ml，芽孢率≥98%。

关键词：解淀粉芽孢杆菌;分离鉴定;发酵

中图分类号：S858.314.4+3     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2019）02-0024-03

病死动物尸体堆肥发酵因其简单实用、经济环保并能产生稳定高效植物肥料的特点，已成为病死动物尸体无害化处理的主流方式，也是符合我国养殖业现状的合理有效的处理方式之一[1]。但是传统的堆肥法主要依靠自然界的微生物进行发酵，发酵过程受环境温度、原材料等因素的影响，发酵效率太低，且占地面积较大。本研究主要是从传统病死鸡尸体发酵堆肥中筛选分解蛋白酶的优势微生物，并研究这些微生物的发酵工艺，将其制备成菌剂，提高病死鸡尸体发酵堆肥的效率。

1  材料与方法

1.1  样品  采用四点取样法取潍坊市某养鸡场病死鸡尸体自然发酵的好氧堆肥升温期的样品。

1.2  培养基

1.2.1  牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，pH7.0。

1.2.2  高氏1号培养基：可溶性淀粉20g，氯化钠0.5g，硝酸钾1g，三水磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.01g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，pH7.5。

1.2.3  真菌培养基采用含有氯霉素的马铃薯琼脂培养基（PDA），青岛海博生产。

1.2.4  蛋白酶菌株筛选培养基：磷酸二氢钾0.36g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化锌0.014g/L，磷酸氢二钠1.07g/L，氯化钠0.16g/L，氯化钙0.002g/L，硫酸亚铁0.002g/L，干酪素4g/L，胰酪胨0.05g/L，琼脂粉20g/L，pH6.8～7.0。

1.3  试验材料  包括豆粕、玉米粉、玉米淀粉、葡萄糖、玉米浆、氯化铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、氯化钠等。

1.4  试验设备  有干燥箱、灭菌锅、摇床、培养箱、50L全自动发酵罐、100～2000L发酵罐等。

1.5  试验方法

1.5.1  产蛋白酶菌株的筛选及分离鉴定  称取10g样品与灭菌的装有90ml生理盐水的锥形瓶中，在摇床上充分震荡30min，采用稀释涂布平板法将10-4、10-5、10-6三个梯度各100μl分别涂布于NA、高氏1号培养基和PDA平板中。每个梯度做4个重复，NA平板放在37℃培养箱中培养1～2d，高氏1号培养基平板和PDA平板放在30℃培养箱中培养3～4d。然后挑选不同形态的菌落分别接种至蛋白酶菌株筛选培养基中培养，细菌菌落放在37℃培养箱中培养1～2d，放线菌和真菌菌落放在30℃培养箱中培养3～4d，观察透明圈。将有透明圈的菌落进一步分离纯化，然后进行保存，并将斜面菌种送至鉴定机构进行菌种鉴定。

1.5.2  解淀粉芽孢杆菌产芽孢培养基及发酵工艺的研究

1.5.2.1  摇瓶配方试验  选择各种发酵常用物料，进行摇瓶配方的摸索，通过多次正交试验，初步确定发酵配方。

1.5.2.2  2000L发酵罐配方试验  在摇瓶配方初步确定的基础上进行50L发酵罐小试，然后用100～2000L发酵罐进行中试，最终确定该菌的发酵配方。

1.5.2.3  100～2000L发酵罐发酵工艺的研究  对发酵罐的通风量和转速进行调整，以促进菌种的快速繁殖。

2  结果与分析

2.1  产蛋白酶菌株的筛选及分离鉴定

2.1.1  产蛋白酶菌株的筛选  经过多轮筛选，最后只有1#菌株在蛋白酶筛选培养基平板上有透明圈，将1#菌株接种至蛋白酶揺瓶培养基培养，检测发酵液酶活，平均酶活为2000U/ml，1#菌株在NA平板和蛋白酶筛选平板上的菌落形态见图1所示。

2.1.2  1#菌株分离鉴定结果  经过鉴定机构的鉴定，1#菌株为解淀粉芽孢杆菌。

2.2  解淀粉芽孢杆菌产芽孢培养基及发酵工艺的研究

2.2.1  揺瓶配方试验  通过多次揺瓶实验，检测揺瓶菌数及芽孢率，最后确定该菌种的揺瓶发酵配方碳源为玉米淀粉、葡萄糖，氮源为豆粕、氯化铵，无机盐为硫酸镁、硫酸锰等。

2.2.2  2000L发酵罐配方试验  上述揺瓶配方适当增加浓度分别进行50L罐小试，100～2000L发酵罐中试，多次重复实验结果（取平均值）如表1。

从表1数据可以看出，50L的发酵配方为摇瓶配方中各组分均增加0.5倍，2000L发酵罐的发酵配方为揺瓶配方中的各组分均增加1倍，放罐芽孢数最高。适当增加揺瓶配方中各组分的浓度有利于提高发酵的放罐芽孢数，这是因为2000L发酵罐的溶解氧比50L发酵罐和三角瓶中的溶解氧效果都好。但是如果配方浓度太大，造成培养基中缺氧，反而容易引起菌体的死亡，不易形成芽孢，影响最终的芽孢数量。

2.2.3  100～2000L发酵罐发酵工艺的研究  在菌种发酵过程中，通过提高发酵罐中的通风量和提高转速，有利于为菌种提供更多的溶解氧，从而促进菌种的快速繁殖，缩短发酵时间，节约发酵成本。表2和表3分别是调整发酵罐的通风量和转速对发酵时间和放罐芽孢数的影响。

从表2、表3中可以看出，有效的调整通风量和发酵罐的转速，可以明显缩短菌种的发酵时间，但是对放罐芽孢数基本没有影响。

3  结论与分析

该研究从潍坊某养鸡场尸体堆肥中分离出了一株产蛋白酶酶活较高的解淀粉芽孢杆菌，经揺瓶实验，蛋白酶酶活可达2000U/ml。近年来，有研究发现解淀粉芽孢杆菌能够产蛋白酶[2，3]，但是大部分都分离自土壤，主要用来做饲料添加剂，用于做尸体发酵方面的报道很少。

芽孢是细菌休眠体，产芽孢细菌在营养条件缺乏时，在细胞内形成圆形或椭圆形的芽孢休眠體。芽孢含水量极低，抗逆性强，能经受高温、紫外线、电离辐射以及多种化学物质灭杀等，条件适宜时，芽孢会重新成为一个细菌[4];由于芽孢较其营养体细胞易保藏、复活率高，是制备菌粉制剂的理想存在形式，所以本研究通过多次反复试验确定了解淀粉芽孢杆菌的2000L发酵罐的产芽孢培养基，并对其发酵工艺进行了优化，缩短了该菌的发酵时间（由原来的25h缩短为20h），降低了发酵成本，为以后制备病死鸡堆肥发酵菌剂提供了基础。

参考文献：

[1]  续彦龙，王丽丽，龚改林，等.堆肥法无害化处理染疫动物尸体的研究进展[J].畜牧与兽医，2015，47（4）：138-140.

[2]  谢为天，李红胜，刘颖，等.一株源于红树林土壤芽孢杆菌的鉴定及其蛋白酶学性质研究[J].广东农业科学，2014，41（9）：155-158.

[3]  付文娟，杨亚晋，王庆，等.高产蛋白酶菌株的筛选及其提高发酵豆粕肽含量效果研究[J].中国畜牧杂志，2013，49（23）：41-46.

[4]  Higgins D，Dworkin J.Recent progress in Bacillus subtilis sporulation[J].Fems Microbiology Reviews，2012，36（1）：131-148.