方俊涛 ,蔡 璨 ,王丽娟 ,张小慢 ,刘尚雨 ,李 萍
(1.中国医学科学院 北京协和医学院阜外医院,国家心血管病中心 心血管病国家重点实验室,北京 100037;2.中国医学科学院 北京协和医学院阜外医院 心血管内科,国家心血管病中心 内分泌与心血管代谢中心,北京 100037)
阿霉素是一种广谱高效的抗癌药物,然而其致命的心脏毒性极大地限制了在临床上的应用[1]。阿霉素所致心脏毒性的机制非常复杂的,包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)的过量产生,细胞膜完整性的破坏及细胞凋亡[2]。ROS的激活可引起DNA的过氧化损伤,导致线粒体膜通透性变化和诱导细胞凋亡[3]。这些因素相互作用,共同导致了阿霉素心脏毒性的发生和发展。
胰高血糖素样肽1(glucagon-likepeptide1,GLP-1)是由肠内分泌L细胞产生的一种肠促胰素,它通过与GLP-1受体结合发挥降糖作用。艾塞那肽是一种GLP-1受体激动剂,研究表明,它除了降糖作用外还具有抗炎、抗氧化应激、抗凋亡、改善心肌梗死等心血管保护作用[4,5]。然而,艾塞那肽对阿霉素致心肌细胞凋亡是否具有保护作用,国内外鲜见报道。本研究旨在探讨艾塞那肽对阿霉素所致心肌细胞凋亡的保护作用。
MTT活性检测试剂盒、Caspase3、Caspase9活性检测试剂盒、线粒体膜电位(△Ψm)检测试剂盒(JC-1)、一步法TUNEL试剂盒及ROS检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所,Annexin-V和PI双染色法试剂盒购于BD Biosciences公司,阿霉素购于大连美仑生物技术有限公司,艾塞那肽购于MCE公司,DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司。
H9c2大鼠心肌细胞株来源于美国标准生物品收藏中心(ATCC)。将H9c2细胞置于含10%胎牛血清的培养基中,在37℃、5%CO2的条件下培养。对心肌细胞进行饥饿24h处理后,阿霉素组给予阿霉素(10μM)刺激24h,艾塞那肽干预组在给予阿霉素0.5h前用艾塞那肽(30nM)进行预处理。
按5×107个/孔将H9c2细胞接种于96孔板,当细胞生长到80%左右融合时进行分组处理,每个组设3个复孔。处理结束后,每孔加入10μl MTT溶液继续孵育4h,然后每孔再加入100μl Formazan溶解液,混匀后37℃孵育4h左右,在570nm测定吸光度(OD)。取3孔OD值的平均数,计算细胞活性:细胞活性=处理组OD/对照组OD×100%。
利用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测3组细胞的凋亡情况。按5×107个/孔将H9c2细胞接种于12孔板,当细胞生长到80%左右时进行分组处理,每个组设3个复孔。处理结束后,用PBS洗涤2次。在样品上加50μl TUNEL检测液,37℃避光孵育60min。用PBS洗涤3次后用抗荧光淬灭封片液封片,并在荧光显微镜下观察。Cy3的激发波长为550nm,发射波长为570nm。
采用Annexin-V和PI双染色法测定细胞凋亡。用4℃的PBS清洗心肌细胞2次,调整细胞浓度为2×106个/孔,在细胞中分别加入FITC标记的Annexin-V和PI各5μl。采用Accuri C6流式细胞仪进行检测分析。
将H9c2细胞均匀接种于12孔板上,当细胞长到约80%时给予不同处理。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度10μmol/L。去除细胞培养液,在12孔板的1个孔中加入1ml稀释好的DCFH-DA,37℃孵育20min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集细胞后在488nm激发波长,525nm发射波长用荧光酶标仪检测。
H9c2细胞经不同处理后,用胰酶消化贴壁细胞,并收集至备用的细胞培养液中,以600g离心5min收集细胞,PBS洗涤1次。按照每200万细胞加入100μl裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解15min后18000g离心15min,把上清转移到冰浴预冷的离心管中,并测定蛋白浓度。根据试剂盒步骤配好反应体系,37℃孵育2h,出现颜色变化较明显时即可测定A405。
当细胞长至约80%时,根据实验设计给予不同处理。用胰酶消化后收集细胞,重悬于0.5ml细胞培养液中,加入0.5ml JC-1染色工作液,混匀。细胞培养箱中孵育20min。孵育结束后,600g离心4min,沉淀细胞,弃上清,用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤 2次,再用适量 JC-1染色缓冲液(1×)重悬后,用荧光酶标仪检测。当线粒体膜电位比较高时,JC-1会聚集在线粒体基质中形成聚合物而产生红色荧光;当线粒体膜电位比较低时,JC-1不能聚集于线粒体基质中,此时JC-1为单体,会发出绿色荧光。这样就可以很方便地借助荧光颜色的变化来检测线粒体中的膜电位变化。常用红色绿色荧光的相对比值来衡量线粒体去极化的程度。
各组细胞在37℃、5%CO2的条件下培养24h后,通过RT-PCR检测每组细胞的Bcl-2及Bax mRNA表达水平,计算Bcl-2/Bax比值。设计的引物如下:Bcl-2上游引物:5‘CTTCAGGGATGGGGTGAACT’3,下游引物:5‘CAGCCTCCGTTATCCTGGAT’3;Bax上游引物:5‘TCATGAAGACAGGGGCCTTT’3,下游引物:5‘GTCCACGTCAGCAATCATCC’3;GAPDH上游引物:5‘GGTTGAGTGAGCAGTTCAC’3,下游引物:5‘GATAACCAGACCACACCTTAGC’3。
应用SPSS 23.0软件进行统计学分析,组间比较采用方差分析。
与空白组相比,阿霉素组H9c2心肌细胞凋亡率显著增加(流式细胞检测法:P<0.01;TUNEL法:P<0.01);与阿霉素组相比,艾塞那肽组H9c2心肌细胞凋亡率显著减少(流式细胞检测法:P<0.01;TUNEL 法:P<0.05),见图1、2(插二)。
表1示,与对照组相比,阿霉素组H9c2心肌细胞活性显著下降(P<0.01);给予艾塞那肽处理后H9c2心肌细胞活性显著增加(P<0.05)。
表1示,与对照组相比,阿霉素组H9c2心肌细胞 ROS、Caspase3、Caspase9活性显著增加(P<0.01);给予艾塞那肽预处理后H9c2心肌细胞ROS、Caspase3、Caspase9 活性显著下降(P<0.05)。
表1示,与对照组相比,阿霉素组H9c2心肌细胞△Ψm、Bcl-2/Bax比值显著下降(P<0.01);与阿霉素组相比,艾塞那肽组H9c2心肌细胞△Ψm、Bcl-2/Bax比值显著增加(P<0.01)。
阿霉素是临床上常用的抗肿瘤药物,它的严重心脏毒性大大限制了临床应用。因此,寻找能够减轻这种不良反应又不影响阿霉素的抗肿瘤功能的心脏保护剂是亟需解决的问题。阿霉素所致的心脏毒性具体机制目前尚未十分清楚,但普遍认为阿霉素所引起的心肌细胞凋亡及ROS的大量生成是心脏损伤的重要机制。
大量研究表明,心肌细胞凋亡参与到多种心血管疾病的发病过程中。细胞凋亡指的是基因水平调控的一种程序性自主死亡过程[6]。细胞凋亡的机制非常复杂,目前普遍认为细胞凋亡主要通过以下3种信号转导途径来实现,包括线粒体介导的凋亡途径、内质网介导的凋亡途径和死亡受体介导的凋亡途径[7]。此外,一些凋亡相关的基因也参与到其中,包括:Bcl-2家族和Caspase家族。因此,如何减轻心肌细胞的凋亡,是当前细胞分子生物学领域的热点。
当阿霉素作用于心肌细胞后,线粒体中呼吸链功能出现异常,产生大量ROS,增加了线粒体膜的通透性,导致△Ψm下降,从而激发Caspases的凋亡级联反应,活化Caspase3等,而Caspase3是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶,是细胞凋亡出现的标志酶,激活后的Caspase3能改变细胞形态及降解DNA,诱导细胞凋亡[8]。研究表明,用不同的处理方式诱导的细胞凋亡中,均可以发现△Ψm在细胞形态变化前有一定程度的下降,说明△Ψm的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。当△Ψm出现损耗时,细胞即进入了凋亡过程。
表1 艾塞那肽对阿霉素诱导的H9c2心肌细胞活性、ROS等指标的影响
除了Caspase家族外,Bcl-2基因家族也是参与细胞凋亡调控的重要调控基因[9]。Bcl-2和Bax同属于Bcl-2家族成员,在凋亡调控中发挥重要作用。Bcl-2具有对抗细胞凋亡功能,通过抑制细胞色素C的释放,进而抑制下游Caspases的激活,发挥其抗凋亡作用[10]。而Bax则具有促进细胞凋亡的作用,当细胞凋亡发生时,Bcl-2/Bax比值下降,Bcl-2/Bax比值常被用于描述细胞凋亡的程度。研究表明,线粒体介导的心肌细胞凋亡途径在阿霉素诱导的心脏毒性中扮演重要角色[11,12]。由于胞内ROS大量生成及ATP消耗使得Bax从细胞液转移到线粒体中,Bcl-2/Bax比值降低,这导致细胞色素C的释放及Caspase3、Caspase9的激活,引起心肌细胞凋亡[13]。研究表明,GLP-1类似物艾塞那肽具有抗炎、抗动脉粥样硬化、减轻心肌缺血再灌注损伤、抑制心肌细胞凋亡等心血管保护作用。在本研究中,我们发现TUNEL法和流式细胞仪检测结果提示阿霉素组H9c2细胞凋亡率显著增加,阿霉素能够引起H9c2细胞活性降低,细胞内ROS水平升高,△Ψm降低,Bcl-2/Bax比值下降,给予艾塞那肽干预后则能显著改善这些不良作用,这提示艾塞那肽能够对抗阿霉素引起心肌细胞凋亡。
综上所述,艾塞那肽能够改善阿霉素引起的心肌细胞凋亡,这为防治阿霉素诱导的心脏毒性提供新的思路。其作用机制可能是减少细胞内ROS的生成,增加△Ψm,降低Bcl-2/Bax比值,从而减少阿霉素诱导的心肌细胞凋亡。