非诺贝特对糖尿病视网膜病变小鼠视网膜神经细胞的保护作用及机制△

石蕊 王博 杨乐

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是一类以视网膜神经变性和微循环障碍为特征的疾病[1]，且糖尿病性视网膜神经细胞损伤可能早于临床可见的微血管病变而影响糖尿病患者早期暗适应能力，因此，越来越多的研究开始关注神经保护在DR早期治疗中的作用[2]。P2X7-NOD样受体蛋白-3(Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3)是炎性反应的经典通路，有研究发现，其在高糖导致的视网膜色素上皮细胞及血管内皮细胞损伤中发挥着重要作用[3]，但其是否在发病早期即引起视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)凋亡坏死的报道尚少。同时，有关DR治疗的最新研究发现，DR进展与糖尿病患者血脂代谢异常有关，且早期口服非诺贝特可有效阻止DR的进展并减少DR患者需要全视网膜激光的比率[4]，从而控制DR的进展[5]，然而其与DR患者神经视网膜损伤的关系尚未完全明确。

本研究拟通过建立DR动物模型，观察高糖对神经视网膜组织中P2X7-NLRP3信号通路表达的影响，同时以口服非诺贝特进行干预对照，从而评价P2X7-NLRP3信号通路在DR神经损伤发生中的作用及非诺贝特的保护作用，为DR的早期防治提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 取健康清洁级雄性C57BL/6J小鼠60只，体质量200～250 g，6～8周龄(西安交通大学医学院动物中心提供)，排除眼部疾病，实验动物的使用遵循ARVO声明。

1.2 主要实验仪器及设备 Bx51多通道荧光显微镜(奥林巴斯，广州市明美光电技术有限公司，日本)，血糖仪[One Touch，Ultra Vue,强生(中国)医疗器材有限公司]，RM2125石蜡切片机(北京昊诺斯科技有限公司)，P2X7、NLRP3抗体(北京生科宇晟科技有限公司)，非诺贝特(0.1 g×20片，杭州民生药业有限公司)，链脲佐菌素(streptozotocin,STZ；福州迈新生物技术开发公司)。

1.3 糖尿病小鼠模型的制备及分组 所有小鼠适应性喂养1周后，应用随机数字表法分为N组(对照组)、D组、F组，每组各20只。禁食12 h，称体质量，D组和F组制作糖尿病模型[6]，STZ临用前以0.1 mol·L-1、pH 4.2的柠檬酸缓冲液溶解配制成10 g·L-1STZ溶液，按50 mg·kg-1体质量腹腔内注射STZ，连续3 d，N组按50 mg·kg-1连续3 d腹腔注射枸橼酸钠缓冲液，注射后给予充足饮水及食物。72 h 后取鼠尾静脉血检测血糖，随机血糖值>16.7 mol·L-1为糖尿病小鼠造模成功。自造模成功后第2天起F组每天每只鼠给予非诺贝特口服100 mg·kg-1，隔日1次[7]，连续12周。造模成功后，每周1次测小鼠的血糖。

1.4 取材方法 所有小鼠连续喂养12周后，分别在4周、8周、12周时在末次给药第2天腹腔内注射100 mg·kg-1水合氯醛进行麻醉，取出双眼眼球，一眼用自制眼球固定液(无水乙醇 60 mL，甲醇10 mL，冰醋酸10 mL，氯仿20 mL)固定后，包埋切片，厚度10 μm，备免疫荧光化学染色；另一眼去除眼前节、玻璃体，用虹膜恢复器完整剥离视网膜后在PBS液中漂洗，清除残存的玻璃体，最后放入1.5 mL Eppendorf管中，液氮冻存备行Western blot检测。

1.5 视网膜免疫荧光化学染色测定视网膜胶质原纤维酸性蛋白表达 体积分数10%正常山羊血清室温封闭3 h，滴加一抗兔抗视网膜胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)(1:5000)，每张切片30 μL，4 ℃过夜，PBS洗涤3次后加入二抗，RBITC标记抗兔IgG抗体(1:100)，每张视网膜上加30 μL，室温孵育1 h，室温避光孵育2 h，PBS 洗涤后抗荧光封片剂封片，倒置显微镜下观察、拍照。

1.6 Western blot检测NLRP3、P2X7蛋白的表达 制备视网膜组织匀浆，上样、电泳、转膜，加入相应的一抗NLRP3(1:500)、P2X7(1:1000)，4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物标记的山羊抗兔抗体(1:10 000) 37 ℃孵育2 h，进行化学发光显影(ECL显色)。采用Image J分析目标条带的吸光度(A)值。根据内参的条带灰度值计算目的条带的相对强度，从而得到目的蛋白的相对含量。

1.7 统计学分析 采用SPSS 21.0统计学软件进行分析。所有数据进行正态性分布检验，不同时间点及同一时间点不同组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后各组小鼠血糖情况 STZ建模成功后，N组小鼠生存状态良好，D组及F组小鼠分别死亡3只、1只。N组小鼠造模后4周、8周、12周血糖差异无统计学意义(F= 1.836，P=0.147)。D组小鼠血糖在造模后4周、8周、12周均有不同程度增长，各时间点间比较差异有统计学意义(F=22.66，P<0.000 1)。F组小鼠血糖在4周开始下降，8周、12周持续下降，各时间点差异有统计学意义(F=1081，P<0.000 1)。

N组、D组及F组三组分别在造模后4周、8周、12周血糖进行组间比较，结果显示：造模后72 h(0周)血糖三组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较结果显示：与N组相比，D组及F组血糖均不同程度升高(tD=-15.94，P<0.001；tF=-15.70，P<0.001)，但D组及F组间差异无统计学意义(t=0.24，P=0.35)。随时间推移，D组血糖持续增加，三组在4周、8周及12周时，血糖组间差异有统计学意义(均为P<0.05)，两两比较结果显示：F组血糖在各时间点均低于D组(t4周=7.06，P<0.001；t8周=8.52，P<0.001；t12周=11.23，P<0.001)，但均高于N组(t4周=-9.99，P<0.001；t8周=-7.01，P<0.001；t12周=-4.14，P<0.001)。见表1。

2.2 非诺贝特处理对糖尿病小鼠视网膜神经上皮层中GFAP活性的影响 在糖尿病小鼠视网膜中，GFAP过表达是视网膜胶质化的特征性分子标记。免疫荧光化学法检测糖尿病诱导发生以及非诺贝特治疗后GFAP的表达。N组GFAP少量表达(图1A)；D组4周时GFAP的诱导表达主要分布于内界膜(inner limiting membrane,ILM)、RGC层和内丛状层(inner plexiform layer,IPL)，提示Müller细胞激活(图1B)。非诺贝特治疗后，F组小鼠视网膜GFAP主要分布在ILM和RGC层，且密度明显减弱(图1C)，提示早期Müller细胞激活被抑制。

表1 非诺贝特对STZ诱导的小鼠血糖的影响

组别n血糖/mmol·L-10周(72 h)4周8周12周N组206.42±0.296.16±0.386.20±0.646.11±0.42D组1722.36±0.7523.21±0.4921.73±0.6621.48±0.74F组1922.12±0.4416.15±0.3813.21±0.7810.25±0.55F值6051787625063438P值<0.001<0.001<0.001<0.001

图1 4周时小鼠视网膜神经上皮层内GFAP免疫荧光化学染色情况。A、B、C分别为N组、D组和F组。GFAP标记为红色，细胞核用DAPI标染，标记为蓝色。放大倍率×400，比例尺=50 μm

2.3 糖尿病小鼠视网膜P2X7、NLRP3蛋白的表达 Western blot检测结果显示(图2)：4周时，三组间差异有统计学意义(FP2X7=203.8，P<0.001；FNLRP3=114.1，P<0.001)。N组中视网膜P2X7和NLRP3蛋白仅有少量表达，而D组二者的表达水平明显升高，与N组差异有统计学意义(tP2X7=-68.94,P<0.001;tNLRP3=-44.88，P<0.01)。经非诺贝特治疗后，F组小鼠视网膜组织中P2X7和NLRP3蛋白的表达水平较D组明显降低(tP2X7=12.01,P≤0.001;tNLRP3=8.892，P<0.001)，但仍高于N组(tP2X7=6.532，P<0.001;tNLRP3=-3.058，P=0.034)。

图2 4周时Western blot检测各组小鼠视网膜P2X7、NLRP3蛋白表达情况

3 讨论

DR是目前世界范围内工作人群致盲的主要病因之一。最新研究发现，炎症反应所造成的视网膜神经胶质及RGC的损伤可能早于微血管病变，最终导致微循环障碍和DR的进展。作为炎症反应的经典通路，P2X7-NLRP3信号通路被认为在糖尿病肾病、心血管病、神经病变中发挥着重要作用，且可能影响视网膜组织进而导致DR的发生和进展[8]。非诺贝特作为传统而有效的降脂药之一，除了降血脂的作用外，还具有显著的抗炎作用[9]，可显著控制DR的进展[10]，然而，其是否可通过抑制早期视网膜神经细胞的炎症反应进而控制DR的进一步发展的报道尚少。

NLRP3炎症小体是天然免疫系统的重要组成部分，其活化可诱导细胞的炎症坏死，在糖尿病等代谢性疾病中，其表达量会显著增加[11]。核苷酸P2X受体是三磷酸腺苷门控的离子通道，可参与炎性反应和免疫反应，诱导细胞损伤甚至凋亡，也是视网膜血管内皮细胞及周细胞缺失、血管通透性增加的主要原因[12]。对于DR的研究发现，高糖诱导的组织缺血缺氧，可激活视网膜色素上皮细胞上P2X7受体，从而活化NLRP3炎性复合体，使其释放炎性介质，从而发挥生物学作用[13]，但其在糖尿病早期的视网膜神经细胞中的作用机制目前尚未完全清楚。

在糖尿病小鼠视网膜中，GFAP过表达是视网膜胶质化的特征性分子标记。李赵伟等[14]研究发现，在糖尿病大鼠中Müller细胞GFAP及炎性因子表达明显升高，而罗格列酮治疗后视网膜组织中GFAP表达明显降低，提示该药对DR具有潜在的保护作用。本研究发现，N组中GFAP少量表达，D组表达明显增加，4周时GFAP的表达主要分布于ILM、RGC层和IPL，提示Müller细胞激活，而非诺贝特治疗后，F组小鼠视网膜GFAP主要分布于ILM和RGC层，且密度明显减弱，提示神经胶质细胞的活动被显著抑制。Western blot检测结果显示：在N组中，视网膜P2X7和NLRP3蛋白仅有少量表达，D组随着时间推移，P2X7和NLRP3蛋白的表达水平逐渐升高；与N组相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；经非诺贝特治疗后，F组小鼠视网膜组织中P2X7和NLRP3蛋白的表达水平较同时期D组明显降低，但仍高于N组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，提示非诺贝特可能通过抑制糖尿病早期视网膜神经细胞中P2X7和NLRP3蛋白的表达进而发挥神经保护作用。

综上所述，DR早期炎症反应所导致的视网膜神经细胞的损伤可能是视网膜病变进展的基础，本研究通过建立DR模型，早期应用非诺贝特可通过抑制炎症经典通路中P2X7及NLRP3炎症小体的表达进而改善和延缓DR的发展，进一步研究ATP-P2X7-NLRP3在早期视网膜神经细胞的损伤可能为临床开发新型药物提供新的研究方向。