茶碱联合红霉素对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症介质及HDAC-2的影响

高少勇，金咏絮，连宁芳，林其昌，陈公平

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以不完全可逆及持续进展的气流受限为特征的全身慢性炎症性疾病，糖皮质激素在治疗该疾病中的应用一直是临床关注的热点[1]。研究发现，COPD患者存在糖皮质激素抵抗现象，原因可能与组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2，HDAC-2)的表达下降有关[2-3]。已有文献报道，在COPD患者中，小剂量茶碱能减轻炎症反应，红霉素具有抗炎作用[4]。本研究以SD大鼠为基础构建COPD大鼠模型，探讨茶碱联合红霉素治疗COPD的效果以及对HDAC-2表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 SPF级雄性SD大鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司(许可证号：HLK0305)]50只，体质量(270±15)g(250～350 g)，适应性饲养1周。

1.1.2主要试剂 红霉素(国药准字H42021990，宜昌人福药业有限责任公司)；茶碱缓释片(国药准字H44023791，广州迈特兴华制药厂有限公司)；DAB显色试剂盒、通用型SP免疫组织化学试剂盒(上海铭博生物科技有限公司)；兔抗大鼠HDAC-2多克隆抗体(美国BioVision公司)；白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)检测试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)；其他试剂均为分析纯国产试剂。

1.1.3主要仪器 超净工作台(AIRTECH，苏州净化设备有限公司)；台式低温高速冷冻离心机(太仓市医疗械厂)；紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)；全自动生化分析仪(iChem-530，深圳市库贝尔生物科技股份有限公司)；电泳仪(上海第三分析仪器厂)；电子天平(BS223S型，北京赛多利斯仪器系列有限公司)；石蜡切片机(上海仙申医教仪器厂)。

1.2方法

1.2.1动物分组 取雄性SD大鼠50只，随机分为正常组(n=10)和COPD组(n=40)，COPD组再采用随机数字表法分为4组，对照组、红霉素组、茶碱组及红霉素+茶碱组，每组各10只。

1.2.2构建COPD大鼠动物模型 取40只大鼠，于第1天和第14天腹腔内注射10%的水合氯醛(3 mg/kg)麻醉大鼠，经口气管插管后滴入0.2 mL(1 g/L)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。第2～13天和第15～30天，放入自制玻璃熏烟箱中被动吸烟，1支/只，持续约0.5 h，每日2次，2次至少间隔6 h。具体方法：将点燃的香烟烟雾通过自制三通管抽吸到50 mL注射器中，关闭吸烟通路一端，打开注射器与熏烟箱连接的通路端，将烟雾注入熏烟箱，使大鼠被动吸烟。香烟(红七匹狼)焦油含量12 mg，烟碱量1.1 mg。正常组(n=10)给予0.2 mL生理盐水和新鲜空气处理。

1.2.3给药方法 第31天，将COPD大鼠随机分为对照组、红霉素组、茶碱组、红霉素+茶碱组，每组10只。对照组予生理盐水灌胃，每日1次，每次2 mL；红霉素组予红霉素(配置成1.25%的红霉素口服液，现配现用)灌胃(100 mg/kg)，每日1次；茶碱组予氨茶碱灌胃(80 mg/kg)，每日1次；红霉素+茶碱组将上述浓度的红霉素及氨茶碱灌胃。各组给药时间均为30 d。

1.2.4标本取材 第61天，将各组大鼠麻醉，以5 mL一次性注射器行心脏穿刺取血，留取5 mL全血，静置20 min，3 000 r/min离心15 min，将血清分装于2 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱中待测。结扎右主支气管，于隆突上用套管针穿刺至左肺，以2 mL生理盐水灌洗左肺，再缓慢回抽，每次回收液体约1.5 mL，如此反复灌洗3次，回收率约75%，再次离心，取上清液放置于-80 ℃冰箱中。留取一侧肺叶，置于50倍体积的4%多聚甲醛中固定6 h，石蜡包埋、切片，准备进行H-E染色和免疫组织化学染色。

1.2.5检测方法 按照说明书步骤进行酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清及肺泡灌洗液中的IL-8及TNF-α水平，并将大鼠的肺组织进行H-E染色，采用免疫组织化学技术检测肺组织中HDAC-2表达，采用图像分析系统测定大鼠肺组织中的HDAC-2的阳性系数。每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，以胞质或胞核内出现黄色或棕黄色颗粒者为阳性细胞，采用图像分析系统采集图像，检测每个高倍镜视野下阳性细胞的平均吸光度值，取平均值作为阳性表达的相对强度，对比各组指标间的差异。

2 结 果

2.1血清及肺泡液IL-8及TNF-α水平 与正常组比较，对照组大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平均显著上升(P<0.05)；经红霉素和茶碱分别处理后，大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平均显著下降(P<0.05)；红霉素+茶碱组大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平均显著低于红霉素组和茶碱组(P<0.05)，具体见表1。

表1 各组大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平比较Tab 1 Comparison of serum and alveolar fluid IL-8 and TNF-α levels in each group ng/L

n=10.IL-8:白细胞介素8；TNF-α：肿瘤坏死因子α.与对照组比较，△：P<0.05；与红霉素组比较，▲：P<0.05；与茶碱组比较，★：P<0.05.

2.2组织学表现特点 正常组大鼠的肺泡及气管上皮结构完整，无肺泡破裂、融合，肺间质无炎性细胞浸润、水肿，肺泡间隔无增厚。对照组大鼠的肺间质可见大量炎症细胞浸润、水肿，肺泡间隔增厚，部分肺泡破裂、融合形成肺大泡。与对照组比较，红霉素组和茶碱组支气管黏膜的增厚程度、炎症细胞浸润明显减轻。红霉素+茶碱组平滑肌细胞、基底细胞排列相对规则，炎症细胞浸润程度较轻，与正常组大鼠的支气管肺组织差别不大(图1)。

2.3HDAC-2表达情况 与正常组(92.53±9.32)比较，对照组大鼠肺组织的HDAC-2表达水平(17.56±1.35)显著降低(P<0.05)；与对照组比较，红霉素组和茶碱组大鼠肺组织的HDAC-2表达水平(33.56±2.85)，(39.65±3.15)均显著上升(P<0.05)；红霉素+茶碱组大鼠肺组织的HDAC-2表达水平(68.75±5.31)均显著高于红霉素组和茶碱组(P<0.05，图2)。

A：正常组，肺泡及气管上皮结构完整，无肺泡破裂、融合；B：对照组，肺泡间隔增厚，部分肺泡破裂、融合形成肺大泡；C：红霉素组，肺间质炎症细胞浸润减轻；D：茶碱组，肺间质炎症细胞浸润明显减轻；E：红霉素+茶碱组，基底细胞排列相对规则，肺泡破坏程度减轻.图1 各组大鼠肺组织组织学表现特点(H-E ×100)Fig 1 H-E staining results of lung tissue of each group of rats (H-E ×100)

HDAC-2：组蛋白去乙酰化酶2.A：正常组，HDAC-2高表达；B：对照组，HDAC-2低表达；C～E：分别为红霉素组、茶碱组及红霉素+茶碱组，均表现为HDAC-2表达上升.图2 各组大鼠肺组织HDAC-2免疫组织化学检测结果(×400)Fig 2 HDAC-2 immunohistochemistry results of lung tissue of each group(×400)

3 讨 论

COPD是一种以气流阻塞为临床特征的慢性气道炎症性疾病，其主要发病因素是吸烟，相关数据显示，90%以上的COPD与吸烟相关[5]，因此，被动吸烟是构建COPD动物模型的经典方法。目前，已有学者采用气道内2次滴入脂多糖联合被动吸烟的方法构建大鼠COPD模型[6]。本研究参照该方法进行，结果显示，对照组大鼠肺组织病理发生明显改变，与人类COPD的病理改变一致，表明COPD大鼠模型构建成功。

目前认为，慢性炎症在COPD的发生发展过程中具有重要作用，多种炎性细胞和细胞因子参与肺组织和气道结构的损伤和重构过程，导致气流受限，发生不完全可逆的进展[7]。IL-8是中性粒细胞趋化因子，而TNF-α是一种强效的促炎症因子，二者均可以促进细胞因子及炎性介质的释放，被证实参与了COPD的发生与发展过程，在COPD的发病过程中发挥重要作用[8-10]。本研究结果显示，在COPD的发病过程中，IL-8和TNF-α表现为较高表达。

研究证实，红霉素长期用于治疗COPD，可显著降低COPD患者急性加重次数及痰液中炎症因子IL-8水平[11]。茶碱类药物具有提高气道平滑肌细胞内环磷酸腺苷浓度、从而抑制磷酸二酯酶的作用，在治疗COPD中效果明显，可通过抑制腺苷受体拮抗腺苷而抑制核因子(NF)-κB的转录，最终降低炎症因子的水平[12]。本研究中，单独应用红霉素或茶碱后，COPD大鼠血清及肺泡液中的IL-8和TNF-α水平明显降低，联合应用红霉素和茶碱后进一步降低。表明二者联合应用治疗效果更佳，可有效减轻炎症反应，这与临床的试验结果一致[13]。

目前，糖皮质激素是治疗COPD最主要的药物，也是最有效的抗炎药物之一。临床研究证实，小剂量糖皮质激素可帮助减轻气道炎症，缓解哮喘患者的症状，但糖皮质激素对多数COPD患者的治疗效果并不理想，易发生糖皮质激素抵抗[14]。糖皮质激素抵抗的机制目前尚不明确，可能的机制包括丝裂原活化蛋白激酶通路被细胞因子激活、巨噬细胞迁移抑制因子增加、转录因子激活通路缺乏、P-糖蛋白介导的药物外排增加、HDAC-2的表达降低等[15]。研究表明，COPD患者中HDAC-2的表达及活性降低与糖皮质激素抵抗密切相关，其对激活的炎性基因去乙酰化作用降低，导致无法阻断炎性基因的转录，从而减弱糖皮质激素的抗炎作用，可能是该类患者发生糖皮质激素抵抗的重要途径[16]。当发生糖皮质激素抵抗时，寻求有效的改善方法在临床应用中是十分必要的。研究显示，红霉素可通过上调HDAC-2蛋白的表达减轻氧化应激下THP-1细胞的糖皮质激素抵抗[17]。氨茶碱能够改善COPD大鼠的肺功能，肺组织的HDAC活性和HDAC-2蛋白表达增高，而肺组织中IL-8水平降低[18]。然而，该研究也发现，氨茶碱并不能在转录水平上影响HDAC-2，但却可以增加其蛋白的表达，具体分子学机制尚不明确。本研究结果表明，红霉素或茶碱均有助于改善COPD大鼠的炎症反应，联合应用效果更好，可以上调HDAC-2表达，推测联合应用2种药物可能可以改善COPD大鼠糖皮质激素抵抗。

综上所述，红霉素和茶碱均可有效减轻COPD大鼠的炎症反应，并上调肺组织的HDAC-2表达水平，且二者联合应用效果更好，但具体的分子机制有待进一步研究。