辅助生殖用培养液中氨基酸含量测定方法研究

柯林楠 黄元礼 王春仁中国食品药品检定研究院 （北京 102629）

内容提要：目的：建立氨基酸分析仪测定辅助生殖用培养液中游离氨基酸的含量的方法，为其质量控制提供依据。方法：采用4%磺基水杨酸沉淀样品中的蛋白质，以外标法测定辅助生殖培养液中的氨基酸含量。结果：18种氨基酸分离度良好，空白无干扰。氨基酸在线性范围内相关系数r均＞0.999。平均加样回收率（n=6）在97.7%～105.2%，RSD均＜2.9%。结论：改方法灵敏、准确，具有良好的重复性和稳定性。可用于辅助生殖培养液中氨基酸含量检测。

自1978年首列“试管婴儿”诞生以来，体外受精-胚胎移植技术已经成为解决不育不孕症的重要技术手段[1]。辅助生殖技术的成功受到很多因素的影响，生殖培养液就是其中之一。生殖培养液为培养配子和胚胎生长发育提供了最优的生存环境和各种所需的营养物质，是体外生殖过程中必不可少的重要物质。胚胎在体外受精-胚胎移植不同阶段，会接触不同种类的培养液。目前商品化的胚胎培养液中含有大量无机盐，碳水化合物，氨基酸，蛋白质等组份。氨基酸作为胚胎培养过程中重要的调控因子，不仅是胚胎生物合成生长所需的重要成分，同时还参与碳水化合物代谢、渗透压及细胞内pH的调节等[2]。有研究报道，不同的氨基酸对胚胎作用不同，有的能起到促进作用，有的反之[3]。有些氨基酸性质不稳定，如谷氨酰胺，在37˚C下容易分解成氨，过多的氨会对细胞生长产生毒性作用。所以有必要对生殖培养液中的氨基酸含量进行控制。目前测定氨基酸的分析方法有：氨基酸分析仪法，高效液相色谱法，阴离子交换色谱-积分脉冲安培法，毛细管电泳法，气相色谱法，液相色谱-串联质谱法等[4]。由于体外生殖培养液中本身添加的氨基酸种类很多，加上其他成分的干扰，给氨基酸准确测定带来很大干扰，有必要建立一套适用于体外生殖培养液中氨基酸的检测方法。利用氨基酸分析仪测定辅助生殖培养液中多种氨基酸含量的方法，目前国内外尚未报道。本研究运用氨基酸分析仪，建立了体外生殖培养液中18种氨基酸含量的测定方法，为该类产品的质量控制提供参考。

1.仪器与试药

1.1 仪器

氨基酸分析仪：日立L-8900；电子天平：Sartorius CP225D；离心机：Sigma 3K15。

1.2 试药

氨基酸（含量测定用）混合对照品（包括天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸，色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸）：中国食品药品检定研究院，批号：111616-201003；牛磺酸：中国食品药品检定研究院，批号：111616-201003。

氨基酸分析仪配套的流动相（茚三酮溶液和缓冲液）：和光纯药工业株式会社。磺基水杨酸：国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

辅助生殖培养液（科室留样）：囊胚培养液（Lot：20171016，20170703）；受精培养液（Lot：20170703）；一步培养液（Lot：20171016）；卵裂培养液（Lot：20171016）。

2.方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：生理体液柱（#2622SC），4.6×60mm，梯度洗脱，分离柱温度：57˚C，反应柱温度：135˚C，柠檬酸锂缓冲液梯度洗脱，缓冲液流速：0.35mL/min，茚三酮流速：0.30mL/min，通道1：检测波长570nm，通道2：检测波长440nm，进样量：20μL。

2.2 混合对照品系列溶液的制备

取18种氨基酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成氨基酸对照品储备液。分别取氨基酸对照品储备液适量，加水稀释配制成氨基酸混合对照品系列溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取样品溶液0.5mL，加入4%磺基水杨酸0.5mL，混合均匀，9400r/min离心15min，取上清液作为供试液。

2.4 系统适应性实验

取氨基酸混合对照品溶液、供试液及空白溶液，按上述色谱条件进行测定，色谱图见图1，由色谱图可以看出，18种氨基酸色谱峰分离效果好，空白无干扰。

2.5 线性关系考察

取氨基酸混合对照品系列溶液，按述色谱条件进行测定，测得峰面积。以峰面积为纵坐标，氨基酸对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。见表1。

2.6 重复性试验

取同一批号囊胚培养液6份（Lot：20171016），按“ 2.3”处理后得到供试溶液，按上述色谱条件进行测定，结果显示，18种氨基酸峰面积的相对标准偏差RSD都在2.8%以下，表明该方法重复性较好。

图1.氨基酸分析仪专属性考察图谱（1a.空白，1b.氨基酸混合对照品溶液，1c.供试溶液）

表1. 18种氨基酸的线性关系

表2.氨基酸回收率测定结果

2.7 稳定性试验

取囊胚培养液供试品溶液（Lot：20171016），按上述色谱条件分别于24h进样，测定峰面积，18种氨基酸的RSD均小于3.0%。

2.8 加样回收试验

精密量取囊胚培养液（Lot：20171016）0.5mL，精密加入氨基酸混合对照品溶液0.5mL，加入 4%磺基水杨酸1.0mL，混合均匀，9400r/min离心15min，取上清液作为供试液，按上述测定条件进样测定，计算回收率，结果见表2。由表可以看出，该方法的平均加样回收率（n=6）在97.7%～105.2%，RSD均＜2.9%。试验结果表明，该方法检测体外生殖培养液中的氨基酸准确可靠。

2.9 样品测定

取样品，分别按建立的测定胚胎培养液中氨基酸含量的氨基酸分析仪法测定，结果见表3。

3.讨论

本研究建立了氨基酸分析仪法测定辅助生殖用培养液中氨基酸的分析方法。方法学试验结果表明该方法对18种氨基酸完全分离，准确度高，重复性好，且不受培养液中其他成分，如碳水化合物等的干扰。采用加磺基水杨酸沉淀蛋白质，高速离心进行分离，可以完全去除蛋白质对氨基酸检测的干扰。本研究几乎覆盖了目前商品化的培养液中所有添加的氨基酸，因此可以应用于培养液中氨基酸的质量控制及配方筛选。体外受精-胚胎移植技术应用是否得当不仅会关系到胚胎的质量，甚至会影响后代的健康，所以它的风险不容忽视。目前很多国家监管部门都出台了相关的文件，比如中国食品药品监督管理总局医疗器械审评中心发布了《人类体外辅助生殖技术用液注册技术审查指导原则》指导原则[5]。欧盟有《Guidelines for Conformity Assessment of In Vitro Fertilisation(IVF) and Assisted Reproduction Technologies(ART) Products》[6]，这些文件都关注到了培养液中氨基酸的质量控制。研究中发现，培养液中添加的谷氨酰胺，含量低于标示量，且稳定性较差，放置24h以上，含量降低很多。与文献[3]报道一致。这也提示出在产品设计上，除了考虑到氨基酸的功能，还要考虑产品的稳定性。在临床使用中，货架期内样品组分是否会发生降解，以及降解产物对胚胎的风险。

表3.氨基酸测定结果(μg/mL)