高效液相色谱-串联质谱法测定牛干巴中敌百虫的方法研究

张加稳

（昆明市食品药品检验研究院，云南昆明 650000）

敌百虫（C4H8O4Cl3P）是一种广谱性磷酸酯类杀虫剂，在弱碱性环境或进入生物体内易转化成毒性更大的敌敌畏。先前在牛干巴腌制过程中，常喷洒敌百虫驱赶蚊虫和蝇以防腐，人体食用过程其残留量易造成食物中毒，中华人民共和国卫生部于2011 年在《食品中可能添加的非食用性物质和易滥用的食品添加剂名单》中禁止在腌制品中添加敌百虫。

早期敌百虫残留量的检测主要采用高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC），目前气相色谱-串联质谱法（GC-MS）和高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）已成为主要检测方法。候逸众等建立分散固相萃取法（DSPE）净化处理火腿样品，气相色谱-质谱法测定29 种有机磷农药残留量，方法回收率为62.9%～115.8%。陈达炜等采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），对腌制食品中敌百虫提取前处理方法进行研究，SPE 和GPC两种净化方法提取敌百虫的平均回收率分别为81.7%～104.2%和72.4%～89.8%。目前未见研究牛干巴中油脂去除溶剂和顺序对敌百虫残留量检测影响的报道，因此，本文对此做了优化研究，建立了高效液相色谱-串联质谱法检测牛干巴中敌百虫残留量的分析方法，具有定性和定量准确可靠、高灵敏度、基质干扰小等优点，适用范围更广，可为腌制食品中有机磷农药残留量的检测分析提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试剂：乙腈、甲醇，均为色谱纯，默克股份两合公司；正己烷、环己烷、丙酮、石油醚，分析纯，西陇科学股份有限公司；甲酸、甲酸铵、乙酸铵、无水硫酸钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：敌百虫，GSB05-2297-2016，农业部环境保护科研监测所。

材料：C18色谱柱（1.8 μm，2.1×50 mm，Agilent）；50 mL 塑料离心管；孔径0.22 μm 有机滤膜；牛干巴样品，市场抽检。

1.2 仪器与设备

EXION-QTRAP4500 高效液相-质谱联用仪，美国AB 公司；电子天平、超声波清洗仪、氮吹仪、高速离心机、精密移液枪、组织捣碎机、容量瓶。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确量取100 μg/mL 的敌百虫标准液，用40%乙腈稀释成质量浓度为1 μg/mL 标准储备液，于4℃冰箱保存。准确量取1 μg/mL 标准储备液，用40%乙腈依次稀释成5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL 的系列标准工作溶液。

1.3.2 样品前处理

准确称取5 g 均匀试样（精确到0.01 g）于5 0 mL 具塞离心管中，加入5 g 无水硫酸钠混匀，加入20 mL 正己烷于40 ℃超声20 min，弃去正己烷，加入10 mL 乙腈超声波清洗仪超声提取10 min，高速离心机5 000 r/min 离心5 min，将有机相转移至50 mL 塑料离心管中，残渣用10 mL 乙腈重复提取2次，合并有机相，于40 ℃氮吹仪上蒸发至近干，准确加入1 mL 40%乙腈水溶液定容，过孔径0.22 μm微孔滤膜后，供高效液相色谱-质谱/质谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

ESI-MS/MS 条件：正离子扫描；MRM 多反应监测；气帘气，离子源雾化气，离子源辅助加热气，分别设定为38、55、55，喷雾电压5.5 kV，加热器温度为550 ℃；优化后的监测离子对（m/z）、去簇电压（DP）、碰撞电压(CE)、驻留时间等结果参数见表1。

表1 敌百虫保留时间及质谱参数

2.2 液相色谱条件的优化

选择Agilent C18色谱柱（2.1×50 mm，1.8 um），分别考察了0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-10 mmol 乙酸铵-乙腈、0.1%甲酸水-10 mmol 甲酸铵-乙腈4 种流动相对检测结果的影响，根据离子对峰型和强度确定的液相色谱条件为：流速：0.25 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；洗脱梯度：流动相A 为含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸铵水溶液，流动相B 为乙腈，0 min～3 min，B 相40%～98%；3 min～4 min，B 相98%～98%；4 min～4.1 min，98%～40%；4.1 min～6 min，B相40%～40%。采用优化后的液相色谱和质谱参数方法对敌百虫标准液采集的离子色谱峰分别如图1所示。

图1 敌百虫标准品的UPLC-MS/MS 色谱图

2.3 油脂的去除

2.3.1 去除油脂有机溶剂的优化

对去除牛干巴油脂的有机溶剂进行选择，分别考察了用环己烷、丙酮、正己烷、石油醚等4 种溶剂去除油脂后提取回收率的高低，其提取回收率依次为90.3%、67.9%、93.6%、86.7%，结果表明，正己烷去除油脂效果最好，丙酮最差，原因可能是丙酮去除油脂率低或敌百虫部分溶于丙酮所致，因此选择正己烷作为去除油脂的有机溶剂。

2.3.2 去除油脂顺序的优化

由于牛干巴中含有较多油脂，会造成较强的基质效应，不利于目标物的提取和检测，故在前处理过程中选定正己烷为去除油脂有机溶剂，对先去除油脂再萃取浓缩和先萃取浓缩再去除油脂2 种模式对比研究。结果表明，两者的提取回收率分别为92.6%和82.1%，前者更高，且先去除油脂再萃取浓缩过程的提取溶剂蒸干时间大大缩短，原因可能是油脂既能降低目标物的提取效率，也能提高萃取混合物溶液的沸点，因此选择先去除油脂再萃取浓缩的提取模式。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系及检出限

敌百虫质量浓度范围在5 ng/mL～100 ng/mL，采用外标法定量，以目标物质量浓度为横坐标，以目标物定量离子对峰面积为纵坐标绘制标准曲线，样品经除油脂萃取浓缩后进行仪器检测，敌百虫的线性方程、相关系数、检出限及定量限见表2。

2.4.2 加标回收率和精密度

在空白样品中分别添加1 μg/kg、2 μg/kg、10 μg/kg 3 个浓度水平的敌百虫标准溶液，每个水平进行6 次平行试验，按照优化后的试验方法测定，计算其加标回收率及精密度，结果见表3。

3 结论

本文建立了高效液相色谱-串联三重四级杆质谱法测定牛干巴中敌百虫残留量的分析方法，分别对油脂去除溶剂、去除顺序、液相色谱和质谱参数进行了优化。该方法采用外标法定量，样品中添加敌百虫1 μg/kg、2 μg/kg、10 μg/kg3 个浓度的加标回收率均在91.22%～100.34%，相对标准偏差均小于10%。该方法操作简便、快速、回收率高、重复性好，能满足国内外相关法规的要求，适合大批量牛干巴中敌百虫残留量的检测分析。

表2 方法的线性方程及灵敏度

表3 样品加标回收率试验结果（n=6）