阿托伐他汀对2型糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化、炎性因子及脂联素的作用研究

王珣，江巍，张磊，陈绪江，董曙光，张远恒

糖尿病心肌病作为常见的糖尿病并发症，是引发心脏意外的主要原因[1-2]。研究发现，糖尿病心肌病病理过程主要显示为在长时间高糖刺激作用下，心肌细胞微环境出现能量代谢紊乱、炎性反应及氧化应激激活，并不断出现心肌纤维化、心肌重构，对生命健康存在严重危害[3]。目前，临床医学针对糖尿病心肌病多以控制血糖及纠正慢性心力衰竭治疗为主，但难以明显控制病情进展。研究发现，表皮生长因子受体(EGFR)对糖尿病心肌病患者的心肌纤维化发展存在促进作用，将EGFR作为靶点寻找新型药物治疗糖尿病心肌病为临床研究重点[4]。近年来，研究发现他汀类药物可对炎性反应进行抑制，改善患者内皮功能，减少心血管不良事件发生率[5]。基于此，本研究对阿托伐他汀对2型糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化、炎性因子及脂联素的作用进行分析，探讨其作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：清洁级的雄性Wistar大鼠60只(3个月龄)，体质量180～200 g，由医院实验中心提供，所有大鼠饲养于清洁级动物房中，恒温(20℃)、恒湿(40%)环境饲养；(2)试剂与药物：链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；阿托伐他汀购自辉瑞制药有限公司；EGFR抗体购自SANTA CRUZE公司；(3)仪器设备：GA-7型血糖仪(长沙三诺生物传感技术有限公司),OPJ-1B型切片机(天津天利航空机电有限公司)，AU2700型全自动生化分析仪(日本OLYMPUS公司)，IX71型显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.2 实验方法 2018年3月—2018年7月在武汉大学附属同仁医院动物实验室进行实验。雄性大鼠60只，随机选择20只作为空白对照组(A组)，给予普通饲料喂养30 d，而后经腹腔注射体积相同的枸橼酸缓冲液；余40只大鼠纳入研究组，每日给予高糖、高脂肪食物喂养(即于常规饲料内加入20%猪油、10%蔗糖)30 d，而后经腹腔注射小剂量STZ(30 mg/kg，溶入浓度为0.1 mol/L的枸橼酸缓冲液内)，14 d后大鼠断尾取血检测血糖水平，血糖水平≥22 mmol/L即糖尿病大鼠模型成功；在此基础上将40只大鼠随机分成糖尿病模型组(B组)、阿托伐他汀组(C组)各20只；C组大鼠在成模后第2日给予阿托伐他汀20 mg· kg-1·d-1灌胃，持续治疗2个月。而A组、B组大鼠则给予等体积的饮用水进行灌胃。

1.3 观察指标与方法 在实验结束时(造模后2个月)使大鼠空腹12～14 h，尾部取血3 ml，离心机离心取上清液待测。

1.3.1 血糖及血脂检测：采用血糖仪检测空腹血糖(GLU)水平；全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、脂联素，所有操作全部参照试剂盒说明书执行，相关试剂盒均由北京奥维亚生物技术有限公司提供。

1.3.2 血清、心肌炎性因子检测：采用放射免疫法检测血清和心肌白介素-6(IL-6)、C-反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)，所有操作全部参照试剂盒说明书执行，相关试剂盒均由碧云天生物技术研究所提供。

1.3.3 心肌组织检测：

1.3.3.1 心肌脂联素和炎性因子检测 采用酶联免疫吸附法检测心肌脂联素水平，所有操作全部参照试剂盒的说明书执行。

1.3.3.2 心肌组织病理学特点 取出大鼠心脏进行固定及脱水、石蜡包埋、切片，以Masson染色，于显微镜下对心肌纤维细胞分布情况进行观察，用图像分析软件对心肌间质胶原的面积进行测定，并对心肌胶原容积分数(CVF)进行计算[6]：CVF=视野内胶原面积/心肌总面积×100%。

1.3.3.3 心肌组织EGFR蛋白检测 采用Western Blot法[7]检测心肌组织内EGFR蛋白，即心肌组织蛋白的提取物通过10% SDS-PAGE电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭12 h，后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗膜3次，再加入一定量的抗EGFR抗体，于37℃环境下孵育2 h；再经PBS溶液冲洗，后加入一定量的二抗，于室温条件下孵育40 min，经PBS冲洗，用ECT显色曝光，并经胶片显影。参照目的条带相关光密度值，对目的蛋白表达情况进行判定。

2 结 果

2.1 3组大鼠血糖及血脂水平比较 GLU、TC、TG水平比较，B组>C组>A组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 3组大鼠的血糖、血脂水平比较

2.2 3组大鼠血清、心肌组织炎性因子比较 大鼠血清、心肌组织IL-6、CRP、TNF-α水平B组>C组>A组(P<0.01)，见表2、3。

表2 3组大鼠血清炎性因子表达水平比较

表3 3组大鼠心肌炎性因子表达水平比较

2.3 3组大鼠血清、心肌组织脂联素比较 血清脂联素水平A组(2.7±0.4)ng/ml>C组(1.2±0.3)ng/ml>B组(0.6±0.2)ng/ml，差异均有统计学意义(q/P=8.164/0.000、14.472/0.000、8.125/0.000)。心肌组织脂联素水平A组(1.6±0.2)ng/ml>C组(0.9±0.1)ng/ml>B组(0.5±0.1)ng/ml，差异均有统计学意义(q/P=7.704/0.000、12.346/0.000、6.328/0.000)。

2.4 心肌形态学比较 A组心肌纤维未发生病变，B组大鼠的心肌纤维细胞显示为蓝色，增生显著，且排列紊乱，相互连接形成网状，C组心肌纤维病变改善明显；B组CVF(13.3±2.1)%高于C组(8.6±1.7)%高于A组(3.5±0.6)%，差异均有统计学意义(q/P=7.425/0.000、9.426/0.000、6.138/0.000)。图1见封3。

2.5 3组大鼠心肌组织EGFR蛋白表达水平比较 大鼠心肌组织内EGFR蛋白光密度值B组>C组>A组 [(4.2±0.8)>(2.3±0.7)>(1.4±0.4)]，差异均有统计学意义(q/P=9.126/0.000、10.218/0.000、6.425/0.000)。

3 讨 论

近年来，随着临床医学深入研究发现，亚临床炎性反应在糖尿病心肌病发生、进展过程中起到重要作用[8]，而炎性反应伴发大量的细胞因子、急性时相蛋白释放，如IL-6、CRP、TNF-α等[9]。研究显示，CRP为独立于三酰甘油、BMI及纤维蛋白原(FG)的重要DM预测指标，而TNF-α多由激活后的单核巨噬细胞系统释放，相关研究发现骨骼肌细胞及脂肪细胞等多数非免疫细胞均能释放TNF-α，且TNF-α能经多种途径诱发糖尿病，故TNF-α为导致胰岛素抵抗的关键致病因子之一[10-11]。

脂联素是脂肪细胞释放的蛋白，具有多种主要的生理功能，如改善糖脂代谢、胰岛素抵抗；降低肥胖患者的体质量；保护心肌细胞[12]；抑制血管细胞的黏附分子、细胞间相关黏附分子在主动脉内皮细胞表达，阻止动脉粥样硬化；抑制巨噬细胞的前体细胞生长，将成熟巨噬细胞相关功能阻断，调节炎性反应[13]。研究发现，针对体外培养的成纤维细胞、心肌细胞，脂联素能发挥抑制TNF-α表达、抗凋亡作用，并且相关研究表明脂联素和2型糖尿病、肥胖及胰岛素抵抗的产生、进展存在密切相关性，故脂联素表达能作为2型糖尿病心肌病发生的独立危险因素[14-15]。本研究结果表明，糖尿病模型组大鼠的血清、心肌组织IL-6、CRP、TNF-α水平明显高于空白对照组大鼠，脂联素水平低于空白对照组；但阿托伐他汀组大鼠的血清、心肌组织IL-6、CRP、TNF-α水平明显低于糖尿病模型组，脂联素水平高于糖尿病模型组，提示炎性反应与糖尿病心肌病发生、进展存在密切关系，而阿托伐他汀能减少血清炎性因子释放，增加脂联素表达，缓解炎性反应。同时，本研究发现糖尿病模型组大鼠的血糖、血脂水平高于空白对照组，但经阿托伐他汀治疗后，阿托伐他汀组大鼠的血糖、血脂、心肌纤维组织增生得到显著改善，故认为阿托伐他汀能对2型糖尿病心肌病大鼠的心肌纤维化、血糖、血脂状况进行改善，分析阿托伐他汀可能直接作用于大鼠的心肌组织[16]。

阿托伐他汀作为临床调节血脂的常用他汀类药物，其药理机制主要为对3-羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)的还原酶活性进行抑制，使甲羟戊酸的合成减少，进而减少血LDL及TC表达水平。随着临床深入研究他汀类药物发现，其于临床防治心肌重构、冠心病及房颤等方面发挥重要作用，分析作用机制可能为抗炎、抗增殖及抗氧化应激[17]。研究显示，他汀类药物能对糖尿病心肌病进行改善，分析原因可能经对心肌细胞炎性反应及氧化应激进行抑制有关，但缺乏较多研究报道证实。EGFR作为跨膜蛋白受体，能经信号传导系统准确地将细胞外信号快速转送至细胞内，对细胞增殖存在促进作用[18]。有研究证实，EGFR于多种实体肿瘤细胞内呈高表达，而于正常的心肌组织内亦存在一定表达，其能将结缔组织生长因子(CTGF)激活，发挥调节细胞增殖、迁移及凋亡作用，加快心肌纤维化[19]。本研究结果显示，糖尿病模型组、阿托伐他汀组大鼠心肌EGFR蛋白表达显著高于空白对照组，但阿托伐他汀组低于糖尿病模型组；提示EGFR蛋白在2型糖尿病心肌病发生、进展过程中发挥促进作用，应用阿托伐他汀治疗能改善糖尿病心肌病大鼠的心肌纤维细胞增殖，其作用靶点可能是EGFR。

综上所述，阿托伐他汀能有效防治2型糖尿病心肌病大鼠的炎性反应，调节脂联素表达，缓解心肌纤维化程度，分析原因可能与阿托伐他汀减少心肌组织内EGFR蛋白的表达有关。

利益冲突：无

作者贡献声明

王珣：设计研究方案，整理、分析资料，撰写论文；陈绪江：修改总指导；张远恒：提出研究思维，分析数据，审批论文；董曙光：收集整理资料，查找参考文献；江巍、张磊：实施研究过程