玻璃酸二甲基硅烷醇酯对黏膜上皮细胞的保护作用

孟祥璟,张祥奎,陈建英,杨素珍，陈玉荣，刘少英，凌沛学,

（1.山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室，山东 济南 205101；2.山东福瑞达生物工程有限公司，山东 济南 250101；3.山东福瑞达医药集团有限公司 山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室，山东 济南 250101）

玻璃酸又名透明质酸（hyalouronic acid， HA），它是构成皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，具有良好的润滑性、黏弹性、高亲水性和保湿性[1-2]，但也存在渗透性差、易降解、黏腻感较强等缺点[3]。玻璃酸二甲基硅烷醇酯（dimethyl silanol hyaluronate，DSHA）是一种HA酯化衍生物，具有保湿、消除黏湿感、抗降解及预防和修复皮肤损伤的作用[4]。研究发现HA能促进角质细胞的生长，从而增加表皮的厚度，提高皮肤的屏障功能，还可为创伤组织提供良好的微环境、促进创伤愈合[5]。DSHA不仅保留了HA优异的保湿效果，还更加稳定，可开发为化妆品原料或医用原料[6]。

DSHA的保湿和隔离作用有助于清除鼻腔污物、消除异物感，使鼻黏膜功能恢复正常，缓解由于干燥环境、雾霾、粉尘、药物刺激等造成的鼻腔干痒、灼热、刺痛等症状，恢复鼻腔黏膜的自净功能，预防和减少鼻炎的发生。本研究拟通过体外实验检测DSHA对兔鼻腔黏膜细胞的毒性，采用醋酸氯己定对兔鼻腔黏膜细胞和人阴道黏膜上皮细胞进行损伤，检测不同浓度DSHA对黏膜的保护作用，为DSHA作为鼻腔黏膜保护剂的开发提供支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ClassII Type A2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造公司）；HERACell 240i CO2培养箱（Thermo Scientific）；倒置相差显微镜（日本Nikon）；Tecan SUNRISE酶标仪（瑞士TECAN）；TS-2000 脱色摇床（北京市新技术应用研究所）。

1.2 试剂与耗材

DSHA（山东福瑞达生物工程）；醋酸氯己定（湖北远成赛创科技公司）；DMEM 培养液，胎牛血清（美国Gibco）；胰蛋白酶-EDTA 消化液，噻唑蓝（MTT，美国 Sigma）；CCK8试剂盒（美国MCE）；DMSO（上海生工）；肌肽（德国 Symrise公司）；透明质酸酶，胶原酶I，青霉素，链霉素（北京索莱宝）；其他为分析纯化学试剂。

细胞培养板，培养瓶，培养皿，无菌离心管（美国 Corning）；0.22 μm无菌滤器（美国Millipore）。

1.3 动物与细胞

新西兰家兔，体质量2.3～2.5 kg[山东省农科院畜牧兽医研究所提供，实验动物许可证号：SCXK（鲁）2009-0013]；兔鼻黏膜上皮细胞（本实验室分离培养）；人阴道黏膜上皮细胞VK2/E6E7（武汉大学细胞库）。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 醋酸氯己定溶液制备 配制为10 mg/ml的乙醇溶液，使用时用培养液稀释至0.01 mg/ml。

2.1.2 肌肽溶液制备 固体粉末用培养液溶解配制为4 mg/ml溶液并推滤除菌，使用时稀释至2 mg/ml。

2.1.3 DSHA溶液制备 用DMSO溶解DSHA，配制为浓度为10 %的母液，用无血清培养液稀释至1.25，0.25，0.05，0.01，0.002 mg/ml系列溶液。

2.2 兔鼻黏膜上皮细胞毒性试验

耳缘静脉空气栓塞法处死新西兰兔，从鼻中隔解剖兔鼻腔，75 %酒精消毒鼻腔内外，将鼻腔组织完全离断，75 %医用酒精浸泡消毒后，在超净台上分离鼻黏膜，剔除周围的软组织。仔细清除鼻腔表层，用刀片削下鼻黏膜并切碎为1～4 mm2小块，放入预冷无菌含有双抗（100 U/mL青霉素和100 μg/ml链霉素）的0.01 mol/L PBS液中，反复冲洗3～5次，将其放置在DMEM完全培养基中，37 ℃孵育0.5～1 h；再次用预冷无菌含双抗的0.01 mol/L PBS清洗孵育，用预热的混合消化酶（0.25 %透明质酸酶、0.05 %胶原酶I和0.05 %胰蛋白酶的混合液）消化40 min，以DMEM完全培养基终止消化。反复吹打消化液，静止5～10 min，1500 r/min离心5 min，弃上清，然后加入DMEM完全培养基，重新悬浮细胞沉淀，将收集到的鼻黏膜细胞按接种于培养瓶。37 ℃、5 %CO2培养箱中培养。24 h后于倒置显微镜下观察细胞贴壁生长情况，每3 d换液一次。

将生长至对数期的细胞收集、计数后，稀释至浓度为5×104个/ml，接种于96孔板，每孔100 μl，置于二氧化碳培养箱培养24 h，实验组各孔分别加含DSHA的培养液100 μl（终浓度为1.25，0.25，0.05，0.01，0.002 mg/ml），阴性对照孔加不含DSHA的培养液100 μl。细胞给药后培养24 h，加入CCK8溶液10 μl，避光，37 ℃孵育4 h，以不含DSHA的培养液200 μl+CCK8 10 μl为空白对照，波长450 nm处测定所有样品孔孵育后溶液的吸光度值（A450）。

式中，A加药为实验组吸光度值，A阴性为阴性对照组吸光度值，A空白为空白对照组吸光度值。

2.3 兔鼻黏膜上皮细胞保护试验[7]

取对数生长期兔鼻腔黏膜上皮细胞100 μl 接种于 96 孔培养板，细胞种植密度为5×104个/mL，置5 % CO2培养箱，37 ℃过夜培养，分为8组：空白对照组，细胞正常培养；阴性对照组，正常培养后用醋酸氯己定（终浓度0.01 mg/ml）处理1 h；阳性对照组，肌肽（2 mg/ml）共孵育后用醋酸氯己定（终浓度0.01 mg/ml）处理1 h；实验组：用不同浓度（终浓度0.002，0.01，0.05，0.25，1.25 mg/ml）DSHA孵育后，用醋酸氯己定处理1 h。醋酸氯己定处理后，吸出孔内培养液，实验组和阳性对照组分别继续加入含不同浓度DSHA或肌肽的培养液，阴性对照组更新培养液但不添加受试物。37 ℃、5 %CO2培养箱培养20 h。然后每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，置培养箱内避光孵育4 h。吸弃上清，每孔加入DMSO 100 μl。避光，置摇床低速振荡20 min，测定570 nm波长处吸光度值A，按下式计算细胞的相对增殖率。

相对增殖率（%）=（An-A0）/（Ay-A0）×100 %

式中，An为实验组吸光度值，Ay为阴性对照组吸光度值，A0为空白对照组吸光度值。

2.4 人阴道黏膜上皮细胞保护试验

按2.3项方法，将对数生长期人阴道黏膜上皮细胞VK2/E6E7用0.01 mg/ml醋酸氯己定处理1 h制备细胞损伤模型，参照2.3项实验步骤以MTT法检测细胞相对增殖率作为评价指标，检测DSHA（浓度0.002～1.25 mg/ml）对人阴道黏膜上皮细胞的保护作用。

2.5 统计方法

3 结果与讨论

3.1 DSHA对兔鼻黏膜上皮细胞增殖率的影响

结果见图1。0.002～1.25 mg/ml浓度范围内，DSHA处理组的细胞相对增殖率均＞98 %，随着浓度的增大，未发现细胞相对增殖率有下降趋势，表明DSHA无明显细胞毒性。

图1 不同浓度DSHA对兔鼻黏膜上皮细胞增殖率的影响（n=6）

3.2 DSHA对兔鼻腔黏膜上皮细胞的保护作用

结果见图2、图3。与阴性对照相比，提前进行药物干预的细胞损伤后的修复状态较好，细胞相对增殖率在60 %以上。其中，阳性对照组提前用2 mg/ml肌肽孵育细胞，对醋酸氯己定造成的损伤的修复效果与阴性对照组相比，差异具有高度统计学意义（P＜0.01）；试验组提前用DSHA孵育细胞，药物浓度大于0.01 mg/ml时，对醋酸氯己定造成的细胞损伤有修复效果，其中药物浓度为0.05 mg/ml时，细胞相对增殖率与阴性对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），浓度为0.25，1.25 mg/ml时，与阴性对照组相比，细胞相对增殖率差异有高度统计学意义（P＜0.01）。浓度低于0.01 mg/ml的药物修复效果较弱，细胞相对增殖率与阴性对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。由图3可见，没有使用醋酸氯己定损伤的细胞（C0）生长良好，阴性对照组（C-）有醋酸氯己定损伤，因无任何药物干预，所以细胞生长状况较差，阳性对照组（C+）有肌肽干预，所以细胞得到了明显的修复。DSHA实验组中，浓度为0.25 mg/ml时，细胞的修复效果最明显；浓度为0.002 mg/ml时，细胞生长状况不良，与阴性对照组相比，只有少量增殖。

图2 不同浓度DSHA对兔鼻黏膜上皮细胞的保护作用（n=6）。

图3 兔鼻腔黏膜上皮细胞损伤模型及不同处理组细胞形态

3.3 DSHA对人阴道黏膜上皮细胞的保护作用

结果见表1。使用醋酸氯己定对VK2/E6E7细胞进行损伤处理后，阳性对照组（肌肽）的细胞相对增殖率与阴性对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。DSHA浓度＞0.01 mg/ml时可减弱醋酸氯己定对VK2/E6E7细胞的损伤作用，其中0.25，1.25 mg/ml组与阴性对照组的细胞相对增殖率差异有统计学意义（P＜0.05）。DSHA浓度低于0.05 mg/ml细胞相对增殖率与阴性对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 DSHA对VK2/E6E7的保护作用（n=6）

4 结论

本研究结果提示DSHA对兔鼻黏膜上皮细胞无毒性，先采用DSHA与细胞共孵育，能减轻醋酸氯己定损伤对黏膜细胞的刺激，对兔鼻腔黏膜上皮细胞和人阴道黏膜上皮细胞的微小损伤的恢复有显著的促进作用。DSHA除保湿、润滑作用外，可有效减轻外界因素对黏膜的刺激，恢复黏膜的正常功能，预防和减少相关疾病的发生，在鼻黏膜保护剂领域有广阔的开发应用前景。