缬霉威高效液相色谱分析方法试验

许文恺　翁伟妍　张宏涛



缬霉威高效液相色谱分析方法试验

许文恺翁伟妍张宏涛

（广东中科英海科技有限公司 广东佛山 528000）

文章针对环境水体中缬霉威，采用高效液相色谱对其进行定性定量分析。以0.01%磷酸溶液+乙腈为流动相，使用4.6 mm×150 mm、粒径为5μm的依利特HypersilODS2色谱柱，以及二极管阵列检测器（PDA检测器），在215nm波长下对缬霉威进行分离和定量分析。结果表明：该分析方法的线性相关系数为0.9999；标准偏差为0.224~1.58 %；平均回收率为99.9~106 %。

缬霉威；高效液相色谱；分析

缬霉威中文别名：异丙菌胺、丙森辛、丙森锌，英文名称：Iprovalicarb，CAS号：140923 -17 -7，分子式：C18H28N2O3。由拜耳公司最先研发的一种氨基酸酯类衍生物，具有独特的全新仿生结构，其作用机理不同于其他防治卵菌纲的杀菌剂。作用机理：作用于真菌细胞壁与蛋白质的合成，从而抑制孢子的侵染和萌发，同时抑制菌丝体的生长，致其变形、死亡。此外，作为一种具有生物活性的杀菌剂，不仅在霜霉科、疫霉属真菌导致的病害上有突出的治疗及铲除效果，而且对促进植株生长也有良好的作用。

随着新型农药的发展和使用，对环境毒理分析的要求也越来越严格了，特别是对水生生物的影响，除了在试验周期内观察其生理死亡状态，还需要测定其水体中农药的含量。故而需要便捷、高效的分析方法对农药成分进行定性定量分析。目前，针对水体中缬霉威的定性定量分析的文献中，还没有单独使用高效液相色谱进行测定，因此有需要介绍此方法，以供检测参考。

1 试验部分

1.1 试剂及设备

1.1.1 试剂和溶液

标准品：缬霉威（标准值：98 %固体粉末，常温保存）。

供试品：95 %缬霉威原药（白色固体粉末，常温贮存）。

溶剂溶液：乙腈（HPLC），乙腈水溶液（V乙腈∶V超纯水=1∶1），0.01 %磷酸溶液，曝气自来水。

1.1.2 仪器设备

Alliancee2695 型高效液相色谱仪。

检测器：PDA检测器（二极管阵列检测器）。

色谱柱：依利特HypersilODS2 （4.6 mm×150 mm），粒径：5 μm。

1.2 色谱条件

柱温箱温度：35.0 ℃，流速：1.000 mL/min，进样量：20.0 μL，检测波长：215 nm。

流动相：0.01 %磷酸溶液：乙腈，梯度见表1。

表1 　梯度洗脱

1.3 工作溶液设计及配制

1.3.1 标准曲线设计

根据液相分析方法的预试验结果，将测定缬霉威的线性范围设计为：0.0500 mg/L，0.100 mg/L，0.200 mg/L，0.500 mg /L，1.00 mg/L，2.00 mg/L，5.00 mg/L和10.0 mg/L。每个浓度采集3个针。

1.3.2 标准贮备溶液

标准贮备溶液配制：准确称取0.01546 g标准品（纯度98 %）于10 mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解，最后用乙腈定容至标线，摇匀得到标准贮备液，其浓度为1.52 ×103mg/L。[浓度C1（mg/L）=标准品实际质量(g)×纯度×100000 ]。

1.3.3 标准溶液配制

用乙腈水溶液（V乙腈∶V超纯水=1∶1）配制浓度分别为0.0500 mg/L，0.100 mg/L，0.200 mg/L，0.500 mg /L，1.00 mg/L，2.00 mg/L，5.00 mg/L和10.0 mg/L的标准曲线溶液。

1.3.4 供试品试验溶液

供试品溶液配制：称0.01012 g供试品于10 mL容量瓶中，准确记录实际称样量，加入2.00 mL超纯水分散后，冷却至室温后，用乙腈定容至标线，摇匀得到供试品贮备液，其浓度为961 mg/L。取0.1042 mL供试品贮备液于10 mL容量瓶中，用乙腈水溶液（V乙腈∶V超纯水=1∶1）定容至标线，摇匀得到供试品试验溶液，浓度为10.0 mg/L。[C2（mg/L）=供试品实际质量(g)×待测成分含量×100000 ]。

1.4 定性定量及添加回收测定

1.4.1 专属性试验

取空白溶剂（乙腈水溶液（V乙腈∶V超纯水=1∶1））、标准溶液（10.0mg/L）和供试品试验溶液（10.0 mg/L）经0.22 μm滤膜过滤后进样测试，各采集1针。

1.4.2 添加回收与重复性试验、检出限试验、定量限（灵敏度）试验设计

曝气自来水添加回收与重复性试验：设计1个空白对照组和2档添加浓度。每档浓度5个重复，基质为曝气自来水，详见表2。对空白对照组与2档试验浓度组一共11 个前处理后得到的样品各采集1针。

表2　 添加回收试验分组及浓度

注：加入体积（mL）=理论添加浓度×基质体积/标准溶液浓度，添加量（µg）=标准溶液浓度×加入体积。

前处理：取5.00 mL试验溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至标线，摇匀后过0.22 μm滤膜过滤，上机待测。

检出限：用浓度为0.0500 mg/L（线性下限浓度）的标准溶液图谱信噪比（S/N）和LOQ水平的平均回收率（AR）计算检出限LOD。(LOD=0.0500 ×3/S/N/AR)

定量限（在曝气自来水添加基质中）：以添加回收试验中，待测物在基质中浓度的最低水平为定量限。

2 分析结果

2.1 专属性

空白溶剂没有色谱峰出现，标准溶液与供试品试验溶液有相同的色谱峰出现。在供试品试验溶液的色谱图中，主峰与最相邻的杂峰之间的分离度R为4.26。

图1 　缬霉威专属性图谱

2.2 标准曲线

2.2.1 标准曲线1

标准曲线1：0.0500 mg/L～1.00 mg/L，Y=3.314 ×104X+1.678 ×102，r=0.9999 。

2.2.2 标准曲线2

标准曲线2：0.500 mg/L～10.0 mg/L，Y=3.356 ×104X+1.729 ×102，r=0.9999 。

2.3 添加回收与重复性（曝气自来水中添加回收试验）

添加浓度0.200 mg/L回收率范围：105 ~109 %，平均回收率：106 %，RSD为1.58 %；

添加浓度19.0 mg/L回收率范围：99.5 ~100 %，平均回收率：99.9%，RSD为0.224 %。

2.4 检出限（LOD）

根据以上高效液相色谱分析方法测得，0.0500 mg/L（线性下限浓度）的标准溶液图谱信噪比（S/N）为10.3；

根据公式计算：LOD=0.0500×3/S/N/AR=0.0500×3/10.3/ 106%=0.0137，即该添加回收方法的检出限（LOD）为0.0137。

2.5 定量限（LOQ）

根据添加回收试验得，该前处理方法的定量限（LOQ）为0.200 mg/L。

3 小结

针对水中缬霉威的测定，该高效液相色谱分析方法，对比气相-质谱联用仪、液相-质谱联用仪均有更优异的检测优势。首先使用的试剂常见、廉价，前处理操作简单，分离效果好、测定简便快速、准确度高、相关性良好，分析测定方法的检出限及定量限符合环境毒理（水生生物）分析范围；其次高效液相色谱仪的使用维护成本较低，普通实验室均可具备检测条件，适用性高，可以作为检测机构以及药企自检的参考方法。

[1]土壤和水中农药分析建立和验证指南.(征求意见稿)｡

[2]农药分析手册[M].化学工业出版社,2012.

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[4]姜宜飞,于荣,孙占岳.缬霉威原药毛细管气相色谱分析方法研究[J].农药科学与管理,2013,34(10).

[5]刘垒.缬霉威的合成工艺研究[D].南京师范大学,2014.

10.3969/j.issn.2095-1205.2019.04.31

许文恺(1991- )女，广东佛山人，助理工程师，主要从事环境毒理检测及化学分析工作；张宏涛(1978- )，男，吉林双辽人，工程师，研究方向：毒理学。

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2095-1205(2019)04-55-02